钙离子荧光探针Cal520AM

钙离子荧光探针Cal-520 , AM是美国AAT Bioquest生产的钙离子荧光探针，钙在各种细胞中充当通用的第二信使。 生命的开始，受精行为，受Ca²⁺调节。 所有类型细胞的许多功能都被Ca²⁺或多或少地调节。 自20世纪20年代以来，科学家们一直试图测量Ca²⁺，但由于Ca²⁺探针的有限性，很少有人成功。 Ridgway和Ashley通过将发光蛋白水母发光蛋白注射到藤壶的巨大肌纤维中来进行Ca²⁺的首次可靠测量。 随后，在20世纪80年代，Tsien及其同事制作了各种荧光指示剂。 其中，基于荧光素的Ca²⁺试剂（如Fluo-3和Fluo-4）为测量Ca²⁺提供了值得信赖的方法。 自从这些Ca²⁺探针发展以来，对Ca²⁺相关的细胞内现象的研究已经飙升。

自从Fluo-3推出以来，Fluo-3成像及其类似物（如Fluo-4）揭示了Ca²⁺信号传导中许多基本过程的空间动力学。 Fluo-3和Fluo-4也已广泛用于流式细胞术和基于微孔板（如FLIPR）的钙检测。然而，对于染料提取物的弱信号和高剂量的丙磺舒需要限制了它们在一些细胞分析中的应用，特别是对于那些对丙磺舒敏感的GPCR和钙通道细胞系。我们开发了无色Cal-520系列钙检测试剂，以解决Fluo-3和Fluo-4的这些局限性。

Fluo-3和Fluo-4在细胞应用中最重要的特性是它们的吸收光谱与氩离子激光源在488nm激发相容，并且响应Ca2 +结合的荧光强度增加非常大。使用我们的Cal-520 Ca²⁺检测试剂保留了这两个有价值的特性。 Cal-520试剂的吸收和发射峰分别为490nm和514nm。它们可以用488nm的氩离子激光很好地激发，并且它们发射的荧光（波长514nm）随着Ca²⁺的增加而增加。确定Cal-520在与Ca²⁺结合后经历> 200倍的荧光增加。由于刺激后许多细胞中Ca²⁺的增加范围通常为5至10倍，因此Cal-520是在该区域中以高灵敏度使用的优异探针。 Cal-520的Kd估计为380nM（22℃，pH 7.0-7.5），但该值可能受pH，粘度和体内条件下结合蛋白的显着影响。

除了方便的488 nm激发波长和钙的大荧光增强外，与包括Fluo-3和Fluo-4在内的所有其他现有荧光钙指示剂相比，Cal-520具有更好的信号背景（S / B）比。此外，Cal-520对位于细胞膜中的有机阴离子转运蛋白具有更强的抵抗力，因此具有比Fluo-3和Flu-4更好的细胞保留特性。这一特性使Cal-520更适合HTS应用。百萤生物是AAT Bioquest的中国代理商，为您提供最优质的钙离子荧光探针。

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钙离子篇：时间轴式讲解应用于钙离子检测的探针

将Cal-520®，AM加载到活细胞中的方案

操作步骤

1.准备HHBS缓冲液，10％Pluronic®F-127溶液和25 mM 丙磺舒溶液

2.在高质量无水DMSO中制备2 mM至5 mM Cal-520®，AM原液
a.Cal-520®，AM的用量：1毫克
b.所需浓度：2 mM
c.在合适的容器中，将1mg的Cal-520，AM与453.33μL的无水DMSO混合。

3.使用10μMCal-520®，AM 4在HHBS中制备2X工作溶液，0.08％Pluronic®F-127和2 mM丙磺舒。
a.最终孔内浓度为Cal-520®，AM：5μM
b.Pluronic®F-127的最终井内浓度：0.04％
c.最终孔内浓度的丙磺舒：1mM
d.在合适的容器中混合16μL的Cal-520，AM，25.6μL的10％Pluronic F-127和256μL的25mM丙磺舒。然后，添加HHBS或您选择的缓冲液，直到体积为3.2 mL。

注意：对于大多数细胞系，我们建议使用Cal-520®的最终浓度，AM为4至5μM。
注意：推荐的Pluronic F-127井浓度最终为0.02％至0.04％。
注意：推荐的最终浓度为1至2.5 mM的丙磺舒。

4.将100μL染料工作溶液加入已经含有100μL培养基的所需孔中。
a.该步骤将染料工作溶液从2X稀释至1X，并将每种组分的最终浓度调节至：5μMCal-520®，AM，0.04％Pluronic®F-127,1mM丙磺舒。

5.孵育
a.将添加染料的培养基在细胞培养箱中孵育60-90分钟。
b.将添加染料的培养基在室温下孵育30分钟。

6.用1.0 mM 丙磺舒，准备HHBS缓冲液（或您选择的缓冲液）
a.在合适的容器中加入160μL的25mM丙磺舒。 接下来，添加HHBS或您选择的缓冲液，直到体积为4 mL

7.用HHBS缓冲液或您选择的缓冲液替换染料工作溶液，使用1.0 mM 丙磺舒。
a.首先，从所需孔中除去200μL染料工作溶液和培养基。
b.在相同的孔中加入200μL含有1.0mM丙磺舒的HHBS（或您选择的缓冲液）。

8.实验观察
a.为您的样品添加所需的处理。
b.在Ex / Em = 492/514 nm进行观察。

附加信息

1 M NaOH配方：
1.在合适的容器中准备2 mL蒸馏水。
2.在混合下向溶液中缓慢加入100mg NaOH。
3.加入蒸馏水至体积为2.5 mL。
4.在室温下将溶液储存在塑料容器中。

注意：步骤2这是一个放热过程，应遵循适当的预防措施和指南。

10％Pluronic F-127配方：
1.将1克Pluronic®F-127（Cat#20050）溶解在10毫升蒸馏水中，制成10％（w / v）储备溶液。
2.在40至50℃的温度下加热10％Pluronic F-127储备溶液约30分钟。
3.根据其储存规格储存多余的10％Pluronic®F-127。

25 mM Probenecid配方：
1.在合适的容器中，将1小瓶（72mg）的丙磺舒（Cat＃20060）溶解在0.3mL的1M NaOH中。
2.加入HHBS或您选择的缓冲液，直至体积为10 mL。
3.根据其储存规格分装并储存任何未使用的25 mM 丙磺舒溶液。

重点提示：
1.可根据实验设置的需要和体积调整浓度。
2.Pluronic®F-127（PF-127）是一种非离子表面活性剂，对细胞无毒。 PF-127通常与染料一起使用AM酯改善其水溶性。
3.如果您的细胞含有有机体阴离子转运蛋白，可将丙磺舒（0.5-1.0 mM）添加到染料工作溶液中减少脱酯化指标的泄漏。
4.细胞加载所需指示剂的确切浓度必须根据经验确定。
5.如果孵育> 2小时，染料在一些细胞系上表现更好。

参考文献

In Neurobiology, Cal-520® AM has been used to study:
» Neuron single action potentials in neocortical neurons both in vitro and in vivo, and associated voltage-dependent calcium channels^[1]
» Superior colliculus in mice in conjunction with two-photon calcium imaging to visualize retinal ganglion cells in the superficial lamina^[2]
» Aldolase C compartments in mice, looking at complex spike synchrony and its relation to sensory processing in awake animals^[3]
» Neural circuits in brain slice and whole brain preparation, specifically looking at individual action potentials in vivo^[4]
» Ca2+ dependent cell signaling pathways using cultured human neuroblastoma SH-SY5Y cells and high-speed video-microscopy^[5]

In Cell Signaling, Cal-520® AM has been used to study:
» Intracellular calcium in sperm using the microplate reader platform as a means to quantitating parameters such as motility^[6]
» Calcium signaling pathways in meniscus fibrochondrocytes by way of visualizing calcium localization and concentration^[7]
» Ca2+ mediated cellular signaling in relation to inositol triphosphate and its flux through gap junctions^[8]
» Retinal wave-mediated formation of calcium transients in Müller glial cells with focus on expression of GCaMP3^[9]
» Ca2+ signaling pathways in zebrafish sperm, specifically looking at calcium flux resulting from cGMP-induced hyperpolarization^[10]

In Cardiology, Cal-520® AM has been used to study:
» Sarcoplasmic reticulum insofar as its role in cardiac excitation-contraction coupling and calcium spark events^[11]
» Optical mapping of calcium in cardiac tissue slices to develop a framework for future investigations into calcium transients^[12]
» Sodium-calcium exchanger functionality and mechanism with regards to burst pacemaker activity in knockout mice^[13]
» Pacemaker modulation in embryonic heart as a function of inositol-1,4,5-triphosphate receptors^[14]
» Calcium current and the role of potassium channel-interacting protein 2 (KChIP2) in mice with regards to heart failure^[15]

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