钙离子荧光探针Fluo8AM CAS 1345980-40-6
| Ex (nm) | 495 | Em (nm) | 516 |
| 分子量 | 1046.93 | 溶剂 | DMSO |
| 存储条件 | 在零下15度以下保存, 避免光照 |
钙离子荧光探针Fluo-8®, AM是美国AAT Bioquest生产的用于钙通量测定的试剂，钙测量对于许多生物学研究至关重要。结合 Ca2+ 时表现出光谱响应的荧光探针使研究人员能够通过使用荧光显微镜、流式细胞术、荧光光谱和荧光酶标仪来研究细胞内游离 Ca2+ 浓度的变化。 Fluo-3 AM 和 Fluo-4 AM 是用于活细胞钙成像的可见光可激发钙指示剂中常用的一种。然而，Fluo-3 AM 和 Fluo-4 AM 在酯酶水解后在活细胞中仅具有中等荧光，并且需要苛刻的细胞加载条件以大化其细胞钙响应。 Fluo-8® 染料旨在细胞负载和钙响应，同时保持方便的 Fluo-3 和 Fluo-4 光谱波长 Ex/Em = ∼490/∼520 nm。 Fluo-8® AM 可在室温下加入细胞，而 Fluo-3 AM 和 Fluo-4 AM 需要 37°C 才能装入细胞。此外，Fluo-8® AM 比 Fluo-4 AM 亮两倍，比 Fluo-3 AM 亮四倍。 AAT Bioquest 提供了一套具有不同钙结合亲和力的出色 Fluo-8® 试剂（Fluo-8® Kd = 389 nM；Fluo-8H™ Kd = 232 nM；Fluo-8L™ Kd = 1.86 µM；Fluo-8FF ™ Kd = 10 µM）。百萤生物是AAT Bioquest 的中国代理商，为您提供优质的钙离子荧光探针。
适用仪器
| 荧光显微镜 | |
| Ex: | FITC 滤波片组 |
| Em： | FITC 滤波片组 |
| 推荐孔板: | 黑色透明底板 |
| 荧光酶标仪 | |
| Ex: | 490 nm |
| Em： | 525 nm |
| Cutoff： | 515 nm |
| 推荐孔板: | 黑色透明底板 |
| 读取模式: | 底读模式/可分液处理 |
实验方案
储备溶液配制
Fluo-8® AM 原液配制
在高质量无水 DMSO 中制备 2 至 5 mM Fluo-8® AM 储备溶液。
工作溶液配制
Fluo-8® AM 工作解决方案
在实验当天，将 Fluo-8® AM 溶解在 DMSO 中或将等分的指示剂储备溶液解冻至室温。使用 0.04% Pluronic® F-127 在您选择的缓冲液（例如 Hanks 和 Hepes 缓冲液）中制备 2 至 20 µM 的染料工作溶液。对于大多数细胞系，建议使用终浓度为 4-5 μM 的 Fluo-8® AM。必须根据经验确定细胞加载所需的确切指示剂浓度。
注意 非离子洗涤剂 Pluronic® F-127 有时用于增加 Fluo-8® AM 的水溶性。可以从百萤进行购买。
注意 如果您的细胞含有有机阴离子转运蛋白，则可将丙磺舒 (1-2 mM) 添加到染料工作溶液中（孔中的终浓度为 0.5-1 mM）以减少去酯化指示剂的泄漏。可以从 百萤购买各种 ReadiUse 丙磺舒产品，包括水溶性、钠盐和稳定溶液。
操作步骤
1.在生长培养基中制备细胞过夜。
2.第二天，将 1X Fluo-8® AM 工作溶液添加到您的细胞板中。
注意：如果您的化合物会干扰血清，请在加载染料之前用新鲜的 HHBS 缓冲液替换生长培养基。
3.在 37°C 的细胞培养箱中孵育 30 到 60 分钟。
注意 将染料孵育 2 小时以上可以提高某些细胞系的信号强度。
4.用 HHBS 或您选择的缓冲液（含有阴离子转运蛋白抑制剂，如 1 mM 丙磺舒）替换染料工作溶液，以去除任何多余的探针。
5.根据需要添加刺激物，并使用配备有 FITC 滤光片组的荧光显微镜或 FDSS、FLIPR 或 FlexStation的荧光板读取器在 490/525 nm 截止波长 515 nm 处检测荧光。
图示
将U2OS细胞以40,000个细胞/100μL/孔接种过夜，置于96孔黑色壁/透明底板中。 除去生长培养基，将细胞分别与100μLFluo-3 AM，Fluo-4 AM和Fluo-8 AM在HHBS中以4μM浓度在37℃，5％CO 2中温育。 孵化器1小时。 用200μLHHBS洗涤细胞两次，然后使用FITC通道用荧光显微镜（Olympus IX71）成像。
试剂应用文献
AMPA receptors in the synapse turnover by monomer diffusion
Authors: Morise, Jyoji and Suzuki, Kenichi GN and Kitagawa, Ayaka and Wakazono, Yoshihiko and Takamiya, Kogo and Tsunoyama, Taka A and Nemoto, Yuri L and Takematsu, Hiromu and Kusumi, Akihiro and Oka, Shogo
Journal: Nature communications (2019): 1--18
Cryo-EM Studies of TMEM16F Calcium-Activated Ion Channel Suggest Features Important for Lipid Scrambling
Authors: Feng, Shengjie and Dang, Shangyu and Han, Tina Wei and Ye, Wenlei and Jin, Peng and Cheng, Tong and Li, Junrui and Jan, Yuh Nung and Jan, Lily Yeh and Cheng, Yifan
Journal: Cell Reports (2019): 567--579
Discrimination of Dormant and Active Hematopoietic Stem Cells by G0 Marker Reveals Dormancy Regulation by Cytoplasmic Calcium
Authors: Fukushima, Tsuyoshi and Tanaka, Yosuke and Hamey, Fiona K and Chang, Chih-Hsiang and Oki, Toshihiko and Asada, Shuhei and Hayashi, Yasutaka and Fujino, Takeshi and Yonezawa, Taishi and Takeda, Reina and others
Journal: Cell Reports (2019): 4144--4158
Ketamine Increases Proliferation of Human iPSC-Derived Neuronal Progenitor Cells via Insulin-Like Growth Factor 2 and Independent of the NMDA Receptor
Authors: Grossert, Aless and ra and Mehrjardi, Narges Zare and Bailey, Sarah J and Lindsay, Mark A and Hescheler, Jürgen and Saric, Tomo and Teusch, Nicole
Journal: Cells (2019): 1139
MRGPRX4 is a bile acid receptor for human cholestatic itch
Authors: Yu, Huasheng and Zhao, Tianjun and Liu, Simin and Wu, Qinxue and Johnson, Omar and Wu, Zhaofa and Zhuang, Zihao and Shi, Yaocheng and Peng, Luxin and He, Renxi and others
Journal: eLife (2019): e48431
P2Y6 signaling in alveolar macrophages prevents leukotriene-dependent type 2 allergic lung inflammation
Authors: Nagai, Jun and Balestrieri, Barbara and Fanning, Laura B and Kyin, Timothy and Cirka, Haley and Lin, Junrui and Idzko, Marco and Zech, Andreas and Kim, Edy Y and Brennan, Patrick J and others
Journal: The Journal of clinical investigation (2019)
Hyperglycaemia disrupts conducted vasodilation in the resistance vasculature of db/db mice
Authors: Lemmey, Hamish AL and Ye, Xi and Ding, Hong C and Triggle, Christopher R and Garland, Christopher J and Dora, Kim A
Journal: Vascular pharmacology (2018): 29--35
Methionine and valine activate the mammalian target of rapamycin complex 1 pathway through heterodimeric amino acid taste receptor (TAS1R1/TAS1R3) and intracellular Ca2+ in bovine mammary epithelial cells
Authors: Zhou, Y and Zhou, Z and Peng, J and Loor, Juan J
Journal: Journal of dairy science (2018): 11354--11363
TRPA1-dependent reversible opening of tight junction by natural compounds with an $\alpha$, $\beta$-unsaturated moiety and capsaicin
Authors: Kanda, Yusuke and Yamasaki, Youhei and Sasaki-Yamaguchi, Yoshie and Ida-Koga, Noriko and Kamisuki, Shinji and Sugawara, Fumio and Nagumo, Yoko and Usui, Takeo
Journal: Scientific reports (2018): 1--13
A new electro-optical approach for conductance measurement: an assay for the study of drugs acting on ligand-gated ion channels
Authors: Menegon, A and Pitassi, S and Mazzocchi, N and Redaelli, L and Rizzetto, R and Roll and JF and Poli, C and Imberti, M and Lanati, A and Grohovaz, F
Journal: Scientific Reports (2017)
Altered spontaneous calcium signaling of in situ chondrocytes in human osteoarthritic cartilage
Authors: Gong, Xiaoyuan and Xie, Wenbin and Wang, Bin and Gu, Lingchuan and Wang, Fuyou and Ren, Xiang and Chen, Cheng and Yang, Liu
Journal: Scientific reports (2017): 17093
Bystander effects elicited by single-cell photo-oxidative blue-light stimulation in retinal pigment epithelium cell networks
Authors: Ishii, Masaaki and Rohrer, Bärbel
Journal: Cell Death Discovery (2017): 16071
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High-throughput screen detects calcium signaling dysfunction in typical sporadic autism spectrum disorder
Authors: Schmunk, Galina and Nguyen, Rachel L and Ferguson, David L and Kumar, Kenny and Parker, Ian and Gargus, J Jay
Journal: Scientific Reports (2017): 40740
参考文献
Fluo-8®AM已被广泛用于研究跨越不同学科的关键生物过程中的钙离子。此类过程包括但不限于G蛋白偶联受体信号传导途径，钙离子通道活性，细胞内/细胞溶质Ca 2+通量和细胞受体的活化。
在肿瘤学中，Fluo-8®AM已被用于研究：
»乳腺癌细胞通过监测细胞内Ca2 +通量与细胞凋亡和2-氨基乙氧基二苯基硼酸盐的抑制作用[1]
»通过硫氧还蛋白结合蛋白2的抗肿瘤活性及其对细胞内钙浓度的依赖性 [2]
»Bcl-1和Bcl-2调节通过钙通量表征的细胞溶质转运 [3]
»Ca2 +流入和钙离子通道活性的NCI-H460细胞作为用于监测非小细胞肺癌的进展的参数 [4]
通过线粒体和内质网途径»Ca2 +释放由HN4细胞和细胞凋亡的CLIC4上调 [5]
在心脏病学，FLUO-8 ®AM已用于研究：
»低能量远场刺激作为心动过速和纤颤的治疗 [6]
»心肌细胞钙激发过程中的钙通量[7]
»心血管疾病背景下心脏传导作为细胞刚性的函数[8]
»心肌细胞中舒张期Ca2 +瞬变和SR-腔和游离细胞质Ca2 +浓度[9]
»通过细胞溶质Ca2 +通量检测唾液腺-1-磷酸（S1P）受体在瓣膜间质细胞中的活化[10]
在神经生物学中，Fluo-8®AM已被用于研究：
»海马CA1神经元，可视化神经元以研究淀粉样蛋白的作用-β在阿尔茨海默病的进展中[11]
»HEK293细胞中的细胞溶质Ca2+浓度及其对Aβ1-42和hAmylin及相关信号通路的调节作用[12]
»G蛋白偶联受体（GPRs）对突触前CA3或突触后CA1锥体细胞中大麻素的反应[13]
»延髓关于吸气爆发的中间神经元和树突状钙活性[14]
»通过细胞内Ca2 +浓度的增加监测组胺激活N2a细胞[15]
在干细胞，发育和分化中，Fluo-8®AM已被用于研究：
»通过Ca2 +通量和膜电位验证多能干细胞（iPSCs）诱导成功能的心肌细胞[16]
»T细胞中的CXCR4和CXCR7受体及其在细胞存活和趋化性中的作用[17]
»在Duchenne肌营养不良的发病过程中源自人诱导的多能干细胞的肌细胞对Ca2 +的摄取[18]
»激动剂诱导的大鼠分化过程中的钙瞬变骨髓间充质干细胞转变为平滑肌细胞[19]
»钙通道阻滞及其对心脏祖细胞增殖和分化的影响[20]
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