钙离子荧光探针Fura-FF, AM CAS 348079-12-9

在比率钙指示剂中，最常用的是 Fura-2 和 Indo-1。 Fura-2 具有激发比率，而 Indo-1 具有发射比率。 Fura-2 是比率成像显微镜的首选，在这种显微镜中，改变激发波长比改变发射波长更实用。结合 Ca2+ 后，Fura-2 表现出吸收位移，可通过扫描 300 至 400 nm 之间的激发光谱观察到吸收位移，同时监测 ~510 nm 处的发射。具有细胞渗透性的 Fura-2FF AM 是 Fura-2 AM 的类似物，具有低得多的钙结合亲和力，Kd ~10 µM。这种 AM 酯形式可以加载到活细胞中。

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实验方案

储备溶液配制

在高质量无水DMSO制备2至5 mM 的Fura-FF AM中储备溶液。

工作溶液配制

Fura-FF AM工作溶液
1.在实验当天，将Fura-FF AM溶解在DMSO中，或将指示剂储备溶液的等分试样解冻至室温。

2.在含有0.04%Pluronic®F-127的缓冲液（例如Hanks和Hepes缓冲液）中制备2至20µM Fura-FF AM工作溶液。对于大多数细胞系，建议使用最终浓度为4-5μM的Fura-FF AM。细胞负载所需指示剂的确切浓度请根据经验确定。

注：非离子洗涤剂Pluronic F-127用于提高Fura-FF AM的水溶性。可从百萤购买各种Pluronic F-127溶液。
注：如果你的细胞含有有机阴离子转运蛋白，可以将丙磺舒（1-2mM）添加到染料工作溶液中（最终井内浓度为0.5-1mM），以减少酯化指示剂的泄漏。多种形式的丙磺舒产品，包括水溶性、钠盐和稳定溶液，可从百萤购买。

操作步骤

以下是我们推荐的将AM酯加载到活细胞中的方案。本方案仅提供指南，实际应根据您的具体需求进行修改。

1.在生长培养基中培养细胞过夜。
2.第二天，将1X Fura-FF AM工作溶液添加到孔板中。
注意：如果你的化合物干扰血清，在染色前用新鲜的HHBS缓冲液代替生长培养基。
3.将加入染料的孔板在37°C的细胞培养箱中培养30至60分钟。
注：将染料培养2小时以上可以提高某些细胞系的信号强度。
4.用HHBS或您选择的缓冲液（含有阴离子转运蛋白抑制剂，如1mM丙磺舒）代替染料工作溶液，以去除任何多余的探针。
5.根据需要添加刺激剂，同时使用配备 Fura 2 滤光片组的荧光显微镜或包含可编程液体处理系统（如 FlexStation）的荧光板读数器测量荧光，Ex/Em1 =​​ 340/510 nm Cutoff475 nm 和Ex/Em2 = 380/510 nm Cutoff475 nm。

试剂应用文献

参考文献