新型钙离子荧光探针Calbryte590AM *细胞渗透性*

新型钙离子荧光探针Cal-520 AM是美国AAT Bioquest生产的钙离子荧光探针，Calbryte 520，Calbryte 590和Calbryte 630提供强大的均匀荧光测定工具，用于检测细胞内钙动员。与现有的钙指示剂（如Fluo-3 AM，Fluo-4 AM和Rhod-2 AM）相比，这些钙敏感染料明显更亮，并提供更高的信噪比，大大提高了细胞内保留和负载效率。表达通过钙发出信号的GPCR或钙通道的细胞可以预装载可以穿过细胞膜的Calbryte 520 AM，Calbryte 590 AM或Calbryte 630 AM。一旦进入细胞内，Cal520 AM，Calbryte 590 AM或Calbryte 630 AM的亲脂性阻断AM基团被细胞内酯酶切割，产生带负电荷的荧光Calbryte 染料，留在细胞内。它们与钙结合后的荧光大大增强。当用激动剂刺激细胞时，该受体表示细胞内钙的释放，这显着增加了Calbryte 520，Calbryte 590或Calbryte 630的荧光。高灵敏度和> 100倍荧光增强的特性使Calbryte 520 AM， Calbryte 590 AM或Calbryte 630 AM是测量细胞内钙的强大指标。

除了方便的激发波长和钙的大荧光增强外，Calbryte 520，Calbryte 590和Calbryte 630主要定位于细胞溶胶中，不像Rhod-2主要位于线粒体中。 此外，Calbryte 590和Calbryte 630的长Ex / Em波长使这些染料成为钙指示剂，可与绿色荧光蛋白（GFP）细胞系进行多色检测。 此外，Calbryte 520，Calbryte 590或Calbryte 630钙测定经过优化，可与大多数现有荧光仪器兼容。 Calbryte 520可在488 nm处激发，并与FITC滤光片组配合使用。 Calbryte 590经过优化，可在555 nm激发，并与TRITC / Cy3滤光片组配合使用。 Calbryte 630经过优化，可在594 nm激发，并与TexasRed®滤光片组配合使用。百萤生物是AAT Bioquest的中国代理商，为您提供优质的钙离子荧光探针。

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新型钙离子荧光探针Calbryte 590, AM在活细胞中的实验方案（点击查看）

钙离子篇：时间轴式讲解应用于钙离子检测的探针

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荧光酶标仪
Ex:	540 nm
Em：	590 nm
Cutoff：	570 nm
推荐孔板:	黑色透明底板
读取模式:	底读模式/可分液处理

实验方案

溶液配制

1.储备溶液配制

Calbryte 590 AM 储备溶液

在无水 DMSO 中制备 2 至 5 mM Calbryte 590 AM 储备溶液。

注意：当在 DMSO 中复溶时，Calbryte 590 AM 是透明、无色的溶液。

2.工作溶液配制

Calbryte 590 AM 工作溶液

2.1实验当天，将 Calbryte 590 AM 溶解在 DMSO 中，或将等份指示剂储备溶液解冻至室温。

2.2在您选择的缓冲液（例如 Hanks 和 Hepes 缓冲液）（货号20011）中用 0.04% Pluronic® F-127 制备 2 至 20 µM Calbryte 590 AM 工作溶液。对于大多数细胞系，建议终浓度为 4-5 μM 的 Calbryte 590 AM。细胞加载所需指示剂的准确浓度必须根据经验确定。

注意：非离子洗涤剂 Pluronic® F-127 有时用于增加 Calbryte 590 AM 的水溶性。可以从百萤购买购买。

注意：如果您的细胞含有有机阴离子转运蛋白，可将丙磺舒 (1-2 mM) 添加到染料工作溶液中（孔中的最终浓度为 0.5-1 mM），以减少脱酯后染料的外漏。各种 ReadiUse 丙磺舒产品，包括水溶性、钠盐和稳定溶液，均可从百萤购买。

 

操作步骤

以下是我们推荐的将Calbryte 590 AM加入活细胞的方案。 该方案仅提供指南，实际应根据您的特定需求进行修改。

a）将细胞在生长培养基中培养过夜。

b）第二天，将 1X Calbryte 590 AM 工作溶液添加到细胞孔板中。

注意：如果您的化合物干扰血清，请在上样前用新鲜的 HHBS 缓冲液替换生长培养基。

c）将载有染料的孔板在细胞培养箱中于 37°C 下孵育 30 至 60 分钟。

注意：孵育染料超过 1 小时可以提高某些细胞系的信号强度。

d）用 HHBS 或您选择的缓冲液（包含阴离子转运蛋白抑制剂，例如 1 mM 丙磺舒，如果适用）替换染料工作溶液，以去除任何多余的探针。

e）将染料加载板在细胞培养箱中孵育约60分钟，然后将板在室温下再孵育15分钟。

f）用HHBS或您选择的含有阴离子转运蛋白抑制剂（如1 mM丙磺舒）的缓冲液替换染料工作溶液，以去除多余的探针。

g）根据需要添加刺激剂，同时使用配备 FITC 滤光片组的荧光显微镜或包含可编程液体处理系统（例如 FDSS、FLIPR 或 FlexStation）的荧光酶标仪在 Ex/Em = 540/590 nm 处测量荧光。

 

参考文献

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