钙离子荧光探针Cal500 , 钾盐

钙离子荧光探针Cal-500 , 钾盐是美国AAT Bioquest生产的钙离子荧光探针，Calbryte 520，Calbryte 590和Calbryte 630提供强大的均匀荧光测定工具，用于检测细胞内钙动员。与现有的钙指示剂（如Fluo-3 AM，Fluo-4 AM和Rhod-2 AM）相比，这些钙敏感染料明显更亮，并提供更高的信噪比，大大提高了细胞内保留和负载效率。表达通过钙发出信号的GPCR或钙通道的细胞可以预装载可以穿过细胞膜的Calbryte 520 AM，Calbryte 590 AM或Calbryte 630 AM。一旦进入细胞内，Cal520 AM，Calbryte 590 AM或Calbryte 630 AM的亲脂性阻断AM基团被细胞内酯酶切割，产生带负电荷的荧光Calbryte 染料，留在细胞内。它们与钙结合后的荧光大大增强。当用激动剂刺激细胞时，该受体表示细胞内钙的释放，这显着增加了Calbryte 520，Calbryte 590或Calbryte 630的荧光。高灵敏度和> 100倍荧光增强的特性使Calbryte 520 AM， Calbryte 590 AM或Calbryte 630 AM是测量细胞内钙的最强大指标。

除了方便的激发波长和钙的大荧光增强外，Calbryte 520，Calbryte 590和Calbryte 630主要定位于细胞溶胶中，不像Rhod-2主要位于线粒体中。 此外，Calbryte 590和Calbryte 630的长Ex / Em波长使这些染料成为钙指示剂，可与绿色荧光蛋白（GFP）细胞系进行多色检测。 此外，Calbryte 520，Calbryte 590或Calbryte 630钙测定经过优化，可与大多数现有荧光仪器兼容。 Calbryte 520可在488 nm处激发，并与FITC滤光片组配合使用。 Calbryte 590经过优化，可在555 nm激发，并与TRITC / Cy3滤光片组配合使用。 Calbryte 630经过优化，可在594 nm激发，并与TexasRed®滤光片组配合使用。百萤生物是AAT Bioquest的中国代理商，为您提供优质的钙离子荧光探针。

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钙离子篇：时间轴式讲解应用于钙离子检测的探针

使用Calbryte 520 AM，Calbryte 590 AM或Calbryte 630 AM酯类

1.操作步骤

        Calbryte AM酯应在使用前在无水DMSO中重新配制。 DMSO储备溶液可以在-20℃下储存（干燥）并避光。 在这些条件下，AM酯应稳定三个月。 以下是我们推荐的将Calbryte 520 AM，Calbryte 590 AM或Calbryte 630 AM酯加入活细胞的方案。 该方案仅提供指南，实际应根据您的特定需求进行修改。

a）在无水DMSO中制备2至5mM Calbryte 520AM，Calbryte 590AM或Calbryte 630AM酯的储备溶液。

b）将Calbryte 520 AM，Calbryte 590 AM或Calbryte 630 AM溶解在DMSO中或将等份的指示剂储备溶液解冻至室温。 在Hanks和Hepes缓冲液（HHBS）或您选择的缓冲液（0.04％Pluronic®F-127）中制备10至20μM的染料工作溶液。 细胞加载所需指示剂的确切浓度必须根据经验确定。

注意：非离子型洗涤剂Pluronic®F-127有时用于增加Calbryte 520 AM，Calbryte 590 AM或Calbryte 630 AM酯的水溶性。 各种Pluronic®F-127可从百萤购买。

c）如果您的细胞（如CHO细胞）含有有机阴离子转运蛋白，可将丙磺舒（1-2 mM）添加到染料工作溶液中（浓度为0.5-1 mM）

注意：各种ReadiUse 丙磺舒（包括水溶性钠盐和稳定溶液）均可从百萤购买。

d）将等体积的染料工作溶液（来自步骤b或c）加入细胞板中。

e）将染料加载板在细胞培养箱中孵育约60分钟，然后将板在室温下再孵育15分钟。

f）用HHBS或您选择的含有阴离子转运蛋白抑制剂（如1 mM丙磺舒）的缓冲液替换染料工作溶液，以去除多余的探针。

g）对于Calbryte 520 AM，在Ex / Em = 490 / 525nm处进行钙测试，对于Calbryte 590 AM，使用540/590nm进行钙测试，对于Calbryte 630 AM，使用610/640nm进行钙测试。

 

2.测量细胞内钙响应

为了确定溶液的游离钙浓度或单波长钙指示剂的Kd，使用以下等式：

[Ca]free = Kd[F ─ Fmin]/Fmax ─ F]

其中F是实验钙水平下指示剂的荧光，Fmin是不存在钙时的荧光，Fmax是钙饱和探针的荧光。

        解离常数（Kd）是探针对钙的亲和力的量度。 与校准溶液相比，荧光指示剂的Ca结合和光谱性质在细胞环境中变化非常显着。 细胞内指标的原位反应校准通常产生显着高于体外测定的Kd值。 通过在离子载体如A-23187,4-溴A-23187和离子霉素存在下将加载的细胞暴露于受控的Ca²⁺缓冲液来进行原位校准。 或者，细胞透化剂如洋地黄皂苷或X-100可用于将指示剂暴露于细胞外培养基的受控Ca²⁺水平。

 

3.结论

        由于Ca ²⁺在生物学中的重要性，已经建立了许多用于分析细胞和/或亚细胞Ca ²⁺活性机制的技术/方法。 尽管用于分析Ca ²⁺活性的每种方法都具有优于其他方法的某些优点，但每种方法也存在缺点。 凭借上述出色的性能，我们相信Calbryte 520，Calbryte 590和Calbryte 630钙检测试剂为各种生物系统中的细胞内钙分析和监测提供了新的强大工具。

        正如可能预测的那样，Ca^{2 +}分析中许多研究人员的兴趣从细胞水平转移到亚细胞水平。 已经发现Ca^{2 +}在整个细胞中均匀分布，并且在多种细胞（例如，卵母细胞，心肌细胞，肝细胞和外分泌细胞）中观察到Ca^{2 +}的细胞内异质性（例如Ca²⁺ waves and Ca²⁺ sparks）。 随着20世纪80年代共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）和2000年代先进的酶标仪（如FLIPR，FDSS和NOVOStar专用于细胞内Ca^{2 +}检测）的出现，细胞内Ca^{2 +}的测量显着加速。 共聚焦激光扫描显微镜的多光子显微镜除了测量其浓度外，还允许在亚细胞水平上对细胞内Ca ²⁺信号传导进行空间和时间分析。

 

参考文献

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