AF350 NHS 酯 *与 Alexa Fluor 350 NHS 酯的结构相同*

Alpha Fluor 350 NHS酯（琥珀酰亚胺酯）与AlexaFluor®350NHS酯相同（AlexaFluor®是ThermoFisher的商标）。它是一种蓝色荧光染料，适合与350 nm紫外激光一起使用。Alpha Fluor 350染料在pH 4至pH 10下是水溶性和pH不敏感的。Alpha Fluor 350的NHS酯（或琥珀酰亚胺酯）是方便的胺反应形式，用于将该染料与蛋白质或抗体结合。

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操作方案

标记寡核苷酸

1.准备以下试剂：

200mMTHPTA [tris（3-羟丙基三唑基甲基）胺]水溶液

100mM CuSO4水溶液

炔烃修饰的低聚水溶液（尽可能浓缩，例如> 10 mg / mL）

100 mM抗坏血酸钠水溶液

10 mM染料叠氮化物水溶液或DMSO溶液（有关推荐的溶剂，请参阅我们的网站）

2.在反应前将CuSO4与THPTA以1：2的比例混合并充分涡旋几分钟。该溶液在冷冻时可稳定数周。

3.向炔烃改性的低聚物溶液中加入过量的染料叠氮化物（摩尔比为2-5当量）。

4.加入5当量的THPTA / CuSO4工作溶液（来自步骤1）。

5.加入10-30当量的抗坏血酸钠。

6.在室温下搅拌，涡旋或摇动反应混合物30-60分钟。

7.乙醇通过所需方法（例如HPLC）沉淀或纯化寡聚物。

 

标记肽

1.准备以下试剂：

200 mM THPTA配体水溶液

100mM CuSO4水溶液

炔烃修饰肽水溶液或DMF溶液（取决于您的肽溶解度，如果可能，> 10 mg / mL）

100 mM抗坏血酸钠水溶液

10 mM染料叠氮化物水溶液或DMSO溶液（有关推荐的溶剂，请参阅我们的网站）

2.在反应前几分钟以1：2的比例孵育CuSO4与THPTA配体。 该溶液在冷冻时可稳定数周。

3.向炔烃修饰的肽溶液中加入过量的染料叠氮化物（摩尔比为5-10当量）。

4.加入5-10当量的THPTA / CuSO4。

5.加入10-20当量的抗坏血酸钠。

6.在室温下搅拌，涡旋或摇动反应混合物30-60分钟。

7.通过HPLC纯化您想要的肽。

 

标记炔烃有机小分子

1.准备以下试剂：

200 mM THPTA配体水溶液

100mM CuSO4水溶液

炔烃化合物水溶液或DMF溶液（取决于您的化合物溶解度，如果可能，> 10mg / mL，）

100 mM抗坏血酸钠水溶液

10 mM染料叠氮化物水溶液或DMSO溶液（有关推荐的溶剂，请参阅我们的网站）。

2.在反应前几分钟以1：2的比例孵育CuSO4与THPTA配体。当冷冻时，该溶液可稳定数周。

3.向炔烃溶液中加入过量的染料叠氮化物（摩尔比为5-10当量）。

4.加入25当量的THPTA / CuSO4。

5.加入50当量的抗坏血酸钠。

6.在室温下搅拌反应混合物30-60分钟。

7.通过色谱或其他方法纯化您想要的分子。

 

标记生物聚合物

1.准备以下试剂：

200 mM THPTA配体水溶液

100mM CuSO4水溶液

炔烃改性的水中生物聚合物（尽可能浓缩，例如> 5毫克/毫升）

100 mM抗坏血酸钠水溶液

10 mM染料叠氮化物水溶液或DMSO溶液（有关推荐的溶剂，请参阅我们的网站）。

2.在反应前几分钟以1：2的比例孵育CuSO4与THPTA配体。 该溶液在冷冻时可稳定数周。

3.向炔烃改性的生物聚合物溶液中加入过量的染料叠氮化物（负载比：5-20染料叠氮化物/炔烃）。

4.加入5摩尔当量（参考染料叠氮化物）的THPTA / CuSO 4。

5.加入10当量的抗坏血酸钠（参见染料叠氮化物）。

6.在室温下搅拌，涡旋或摇动反应混合物30-60分钟。

7.通过凝胶过滤或透析纯化您想要的分子。

 

标记细胞，细胞裂解物或生物样品

1.准备以下试剂：

水性缓冲液或100mM THPTA配体水溶液

20mM CuSO4水溶液

300mM抗坏血酸钠水溶液

2.5mM炔烃或叠氮化物标记试剂水溶液或DMSO溶液

2.对于每个叠氮化物或炔烃修饰的细胞或细胞裂解物样品，将以下试剂加入1.5 mL微量离心管中，然后短暂涡旋混合。

50μL细胞或细胞裂解液样品

50μLPBS缓冲液

50μL5mM相应的染料叠氮化物水溶液或DMSO溶液（或染料炔烃）检测试剂

3.加入10μL100mM THPTA溶液，短暂涡旋混合。

4.加入10μL20mM CuSO4溶液，短暂涡旋振荡。

5.加入10μL300mM抗坏血酸钠溶液以引发点击反应，短暂涡旋混合。

6.保护点击反应不受光照，使其在室温下孵育30分钟。

7.点击标记细胞或细胞裂解物并准备用于下游处理和/或分析。

 

参考文献

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Synthetic Protocol for AFCS: A Biologically Active Fluorescent Castasterone Analog Conjugated to an Alexa Fluor 647 Dye
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Alteration of AMPA Receptor-Mediated Synaptic Transmission by Alexa Fluor 488 and 594 in Cerebellar Stellate Cells
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Alexa fluor-labeled fluorescent cellulose nanocrystals for bioimaging solid cellulose in spatially structured microenvironments
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A mouse monoclonal antibody against Alexa Fluor 647
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In vivo visualization of GL261-luc2 mouse glioma cells by use of Alexa Fluor-labeled TRP-2 antibodies
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Green tea catechins quench the fluorescence of bacteria-conjugated Alexa fluor dyes
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Volume labeling with Alexa Fluor dyes and surface functionalization of highly sensitive fluorescent silica (SiO2) nanoparticles
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Fluorescence of Alexa fluor dye tracks protein folding
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a Luo-acupoint) in the rat: a double-labeling study of cholera toxin subunit B conjugated with Alexa Fluor 488 and 594]
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Journal: Zhen Ci Yan Jiu (2011): 262-7

 

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