Amplite NADP检测试剂盒（荧光法）蓝色荧光

Amplite NADP检测试剂盒 （荧光法）蓝色荧光是美国AAT Bioquest研发的检测NADP的试剂盒，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD +）和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADP +）是活细胞中发现的许多酶反应的两个重要辅助因子。 NAD形成NADP，通过酯键将磷酸基团添加到腺苷核苷酸的2'位置。 NADP用于合成代谢生物反应，例如脂肪酸和核酸合成，其需要NADPH作为还原剂。在叶绿体中，NADP是在光合作用的初步反应中重要的氧化剂。通过光合作用产生的NADPH用作卡尔文光合作用循环中生物合成反应的还原能力。量化这些因子的产生或消耗是监测酶介导的反应或筛选这些酶反应的调节剂或底物的重要方法。市场上有几种用于量化NADPH或总NADP / NADPH量的试剂盒，但迄今为止在大量过量NADPH存在下检测NADP是非常具有挑战性的，因为NADP在260 nm处具有其吸收峰且不发荧光，使测量不实用。

Amplite 荧光NADP分析试剂盒可快速，快速地检测NADP。该试剂盒使用我们新开发的NADP传感器Quest Fluor NADP试剂直接测量NADP。该试剂盒中使用的专有探针仅与NADP反应产生在Ex / Em = 420 / 480nm处荧光的产物，并且对NADPH几乎没有响应。该试剂盒可在100μL测定体积中检测少至30 nM NADP，并在过量NADPH存在下监测0.3％NADP产生。该测定可以以方便的96孔或384孔微量滴定板形式进行，并且可以用于高通量筛选。百萤生物是AAT Bioquest的中国代理商，为您提供优质的NADP检测试剂盒。 

96孔板检测示例

概述

准备NADP标准品或测试样品（50μL）

添加20μLQuestFluor™NADP探针

添加20μL测定溶液

在室温下孵育10-20分钟

添加15μL增强剂溶液

在室温下孵育10-20分钟，监测420/480 nm的荧光

注意：在开始实验之前，在室温下解冻每个试剂盒组分。

 

操作步骤

1.准备NADP储备溶液：

将500μlddH2O加入到NADP标准品（组分D）的小瓶中以制备1mM NADP储备溶液。

注意：未使用的NADP储备溶液应分成单次使用的等分试样并储存在-20 ℃。

 

2.准备NADP标准品的连续稀释液（0至10μM）：

2.1将10μL的NADP储备液（来自步骤1）加入到990L H2O或PBS缓冲液中以产生10M NADP标准溶液。

注意：稀释的NADP标准溶液不稳定，应在4小时内使用。

2.2取200μL10μMNADP标准溶液，在H2O或PBS中进行1：3连续稀释，得到NADP标准品的10,3,1,0.3,0.1,0.03,0.01和0μM系列稀释液。

2.3如表1所述，将50μL系列稀释的NADP标准品和含有NADP的测试样品加入黑色/固体底96孔微孔板中：

 

表1黑色/固体底部96孔微孔板中NADP标准品和测试样品的布局

BL	BL	TS	TS
NS1	NS1	….	….
NS2	NS2
NS3	NS3
NS4	NS4
NS5	NS5
NS6	NS6
NS7	NS7

注意1：NS = NADP标准，BL =空白对照，TS =测试样品。

注意2：将连续稀释的NADP标准品（10μM至0.01μM）加入NS1至NS7的孔中，一式两份。

 

3.运行NADP测定：

3.1将20μLQuestFluor NADP探针（组分A）溶液加入NADP标准品，空白对照品和测试样品的每个孔中，充分混合。

3.2将20μL测定溶液（组分B）加入每个孔中，充分混合。

注意：对于384孔板，每孔加入25μL样品和10μLQuestFluor™NADP探针和10μL分析溶液。

3.3在室温下孵育反应10-20分钟，避光。

3.4向每个孔中加入15μL增强剂（组分C），使总NADP测定体积为105μL/孔，并在室温下孵育10-20分钟，避光。

注意：对于384孔板，添加7.5 uL增强剂。

3.5使用荧光板读数器在420/480 nm处检测荧光增加。

 

数据分析

        空白孔中的荧光（仅用H 2 O或PBS缓冲液）用作对照，并从具有NADP反应的那些孔的值中减去。 NADP标准曲线如图1所示

图1 使用Germini酶标仪（Molecular devices），在96孔黑色/固体底板中用Amplite 荧光NADP测定试剂盒测量NADP剂量反应。 A：NADP标准曲线，在孵育20分钟时可检测到低至30nM的NADP（n = 3）。 B：NADP和NADPH响应的比较C：在溶液中存在100μMNADPH的NADP标准曲线。 从孵育20分钟（n = 3）可以检测到从NADPH转化的低至0.3％的NADP（~300nM）。

 

参考文献

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