Amplite 总NAD和NADH检测试剂盒（比色法）增强灵敏度

Amplite 总NAD和NADH检测试剂盒 （比色法）增强灵敏度是美国AAT Bioquest研发的检测总NAD和NADH的试剂盒，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD +）和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADP +）是细胞中发现的两种重要的辅因子。 NADH是NAD +的还原形式。 NAD形成NADP，通过酯键将磷酸基团添加到腺苷核苷酸的2'位置。传统的NAD / NADH和NADP / NADPH测定基于监测340nm处NADH或NADPH吸收的变化。 NAD / NADH和NADP / NADPH测定的短紫外波长使得传统方法具有低灵敏度和高干扰。 AAT Bioquest的Amplite 比色总NAD / NADH检测试剂盒为检测总NAD和NADH提供了一种便捷的方法。系统中的酶特异性识别酶循环反应中的NAD / NADH。无需从样品混合物中纯化NAD / NADH。酶循环反应显着提高了检测灵敏度。 NADH探针是一种生色传感器，在NADH减少时具有460nm的最大吸光度。 NADH探针的吸收与溶液中NADH的浓度成正比。 Amplite™比色法总NAD和NADH分析试剂盒提供灵敏的分析，可在100μL分析体积中检测低至0.1μM的总NAD / NADH。与试剂盒＃15258相比，该试剂盒具有更高的灵敏度。百萤生物是AAT Bioquest的中国代理商，为您提供最优质的总NAD和NADP检测试剂盒。

96孔板检测示例

概述

准备NAD / NADH反应混合物（50μL）

加入NADH标准品或测试样品（50μL）

在室温下孵育15分钟至2小时

监测460 nm处的吸光度

注意：在开始实验之前，在室温下解冻每个试剂盒组分中的一个。

 

操作步骤

1.准备NADH储备溶液：

将200μLPBS缓冲液加入到NADH标准品（组分C）的小瓶中以制备1mM（1nmol / L）NADH储备溶液。

注意：未使用的NADH储备溶液应分成单次使用的等分试样并储存在-20 ℃。

 

2.准备NAD / NADH反应混合物：

2.1将8 mL NADH探针缓冲液（组分B-II）加入到NAD / NADH回收酶混合物（组分A）的瓶中，并充分混合。

2.2将2 mL NADH探针（组分B-I）加入上述瓶中（来自步骤2.1）并充分混合。

注意：这种NAD / NADH反应混合物足以进行200次分析。未使用的NAD / NADH反应混合物应分成一次性等分试样并储存在-20℃。

 

3.准备NADH标准品的系列稀释液（0至10μM）：

3.1将10μL1mMNADH储备溶液（来自步骤1）加入990L PBS缓冲液（pH7.4）中，得到10μM（10pmol / L）NADH标准溶液。

注意：稀释的NADH标准溶液不稳定，应在4小时内使用。

3.2取200μL10M NADH标准溶液（来自步骤3.1）进行1：2连续稀释，得到5,2.5,1.25,0.625,0.313,0.156,0.078和0 M系列稀释的NADH标准品。

3.3如表1和2中所述，将含有NADH标准品和含NAD / NADH的测试样品的系列稀释液加入白色/透明底96孔微量培养板中。

注意：根据需要准备细胞或组织样本。

 

表1：白色/透明底96孔微孔板中NADH标准品和测试样品的布局

BL	BL	TS	TS
NS1	NS1	….	….
NS2	NS2
NS3	NS3
NS4	NS4
NS5	NS5
NS6	NS6
NS7	NS7

注意：NS = NADH标准，BL =空白对照，TS =测试样品

 

表2：每个孔的试剂组成

NADH Standard	Blank Control	Test Sample
Serial Dilutions*: 50 μL	PBS: 50 μL	50 μL

*注意：将连续稀释的NADH标准品（0.078μM至5μM）加入NS1至NS7的孔中，一式两份。 高浓度的NADH（例如，>100μM，最终浓度）将导致饱和信号并使校准曲线非线性。

 

4.在上清液反应中运行NADH测定：

4.1将50μLNAD/ NADH反应混合物（来自步骤2.2）加入NADH标准品，空白对照和测试样品的每个孔中（参见步骤3.3），使总NAD / NADH测定体积为100μL/孔

注意1：对于384孔板，每孔加入25μL样品和25μLNADH反应混合物。

注意2：根据需要准备细胞或组织样本。 为方便起见，裂解缓冲液（组分D）可用于裂解细胞。

4.2在室温下孵育反应15分钟至2小时，避光。

4.3用吸光度读板仪在460 nm处检测吸光度的增加。

 

数据分析

        空白孔中的吸光度（仅用PBS缓冲液）用作对照，并从具有NADH反应的那些孔的值中减去。 NADH标准曲线如图1所示。

图1. Amplite™比色NADP / NADPH比率分析试剂盒用于使用SpectraMax酶标仪（Molecular devices）测量白色/透明96孔微量培养板中的总NADP / NADPH量和NADP / NADPH比率。

A-总NADPH和NADP剂量反应：孵育1小时可检测到低至0.03μM的总NADPH。

B-NADP / NADPH比例：用或不用NADP提取溶液处理等量的NADP和NADPH混合物15分钟，然后在室温下用提取溶液中和。 在460nm读取信号。 NADP / NADPH摩尔比基于图1B中所示的吸光度计算。

 

附录：使用组分G（NAD / NADH裂解缓冲液）的测试样品制剂

1.植物细胞样品：

用裂解缓冲液以200mg / mL均化，并以2500rpm离心5-10分钟，使用上清液进行测试。

 

2.细菌样品：

离心收集细菌细胞（（10,000 g，0°C，15 min）。使用约1亿至1千万细胞/ mL裂解缓冲液，将处理后的溶液在室温下保持15分钟。以2500 rpm离心5分钟， 用上清液进行试验。

 

3.哺乳动物细胞样本：

从平板孔中取出培养基，每1-5百万个细胞使用约100μL裂解缓冲液（或在96孔细胞培养板中使用50-100μL/孔），并将处理过的溶液在室温下保持15分钟。 直接使用细胞裂解液或以1500 rpm离心5分钟，使用上清液进行测试。

 

4.组织样品：

称取约20mg组织，用冷PBS洗涤。 在微量离心管中用400μl裂解缓冲液均化。 以2500rpm离心5-10分钟，使用上清液进行测定。

 

参考文献

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