Amplite NADP/NADPH比率检测试剂盒(比色法)

Amplite NADP/NADPH比率检测试剂盒 （比色法）是美国AAT Bioquest研发的检测NADP/NADPH的试剂盒，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADP）是细胞中发现的两种重要的辅酶。 NAD形成NADP，通过酯键将磷酸基团添加到腺苷核苷酸的2'位置。 NADH（NADPH）是NAD（NADP）的还原形式，NAD（NADP）是NADH（NADPH）的氧化形式。 NAD或NADP在氧化还原反应中起辅助因子的作用，在细胞反应中转移电子。 氧化形式和还原形式之间的平衡是NAD / NADH（NADP / NADPH）比率。 该比率是指示细胞氧化还原状态的重要组分，并且它是反映代谢活性和细胞健康的测量。 在健康的哺乳动物组织中，游离NAD和NADH之间的比率的估计可以高达700。相反，NADP / NADPH比率通常为约0.005，因此NADPH是该辅酶的主要形式。

该Amplite 比色NADP / NADPH比率分析试剂盒提供了一种比色法，用于测量培养细胞中细胞内总NADP / NADPH量和NADP / NADPH比率。 在该测定中，裂解物中的NADPH可以用NADPH提取溶液提取，然后通过NADPH探针识别，在反应后得到黄色染料，其在460nm处具有吸光度。 产生的染料量与细胞裂解物中NADP或NADPH的浓度成正比，可用作细胞NADP / NADPH浓度的指示剂。百萤生物是AAT Bioquest的中国代理商，为您提供优质的NADP/NADPH检测试剂盒。 

---

吸光度酶标仪
吸光度:	460 nm
推荐孔板:	透明底板

96孔板检测示例

概述

准备25μLNADPH标准品和/或测试样品

加入25μLNADPH提取液

在室温下孵育15分钟

加入25μL中和溶液

加入75μLNADPP/ NADPH反应混合物在室温下孵育15分钟至2小时监测 在460nm处的吸光度

注意：在开始实验之前，在室温下解冻每个试剂盒组分中的一个。

 

操作步骤

1.准备NADPH原液：

将200μLPBS缓冲液加入到NADPH标准品（组分C）的小瓶中，得到1mM（1nmol / L）NADPH储备溶液。

注意：未使用的NADPH原液应分成单次使用的等分试样并储存在-20℃。

 

2.制备NADP / NADPH反应混合物：

2.1将8mL NADPH探针缓冲液（组分B-II）加入到NADP / NADPH回收酶混合物（组分A）的瓶中，并充分混合。

2.2将2 mL NADPH探针（组分B-I）加入上述瓶中（来自步骤2.1）并充分混合。

注意：这种NADP / NADPH反应混合物足以进行125~200次分析。 未使用的NADP / NADPH反应混合物应分成一次性等分试样并储存在-20℃。

 

3.准备连续稀释的NADPH标准品（0至2μM）：

3.1将2L 1mM NADPH储备溶液（来自步骤1）加入998L PBS缓冲液（pH7.4）中，产生2M（2 pmols / L）NADPH标准溶液。

注意：稀释的NADPH标准溶液不稳定，应在4小时内使用。

3.2取200μL2MNADPH标准溶液（来自步骤3.1）进行1：2连续稀释，得到1，0.5,0.25,0.125,0.0625,0.0313和0M系列稀释的NADPH标准品。

 

4.运行总NADP / NADPH分析（总共400个分析/试剂盒）：

4.1如说明书中的表1和2中所述，将NADPH标准品和含有NADP / NADPH的测试样品的系列稀释液加入白色/透明底96孔微孔板中。

注意：根据需要准备细胞或组织样本。 为方便起见，裂解缓冲液（组分G）可用于裂解细胞。 （详见附录）。

4.2将50μL的NADP / NADPH反应混合物（来自步骤2.2）加入NADPH标准品，空白对照和测试样品（来自步骤4.1）的每个孔中，以使总NADP / NADPH测定体积为100μL/孔。

4.3在室温下孵育反应15分钟至2小时，避光。

4.4使用吸光度读板仪在460 nm处检测吸光度的增加。

 

5.运行NADP / NADPH比率分析（总共250个分析/试剂盒）：

5.1如说明书中的表3和4中所述，将连续稀释的NADPH标准品和/或含NADP / NADPH的测试样品加入白色/透明96孔微量培养板中。

注意：根据需要准备细胞或组织样本。 为方便起见，裂解缓冲液（组分G）可用于裂解细胞。

5.2对于NADPH提取（NADPH量）：将25μLNADPH提取溶液（组分D）加入含有NADP / NADPH的测试样品的孔中。在室温下孵育10至15分钟，然后加入25μL中和溶液（组分E）以中和NADPH提取物，如说明书中的表3和4中所述。

对于总NADP和NADPH（总量）：将25μLNADPP/ NADPH对照溶液（组分F）加入NADPH标准品的孔和含有NADP / NADPH的测试样品中。在室温下孵育10至15分钟，然后如说明书中的表3和4中所述添加25μL提取对照溶液（组分F）。

注意：根据需要准备细胞或组织样本。为方便起见，裂解缓冲液（组分G）可用于裂解细胞（详见附录）。

 

5.3将75μL的NADP / NADPH反应混合物（来自步骤2.2）加入NADPH标准品，空白对照和测试样品（NADP / NADPH）的每个孔中，并测试样品（NADPH提取物）（来自步骤5.1）以使总量达到测定体积为150μL/孔。

5.4在室温下孵育反应15分钟至2小时，避光。

5.5使用吸光度读板仪在460 nm处检测吸光度的增加。

 

数据分析

        空白孔中的吸光度（仅PBS缓冲液）用作对照，并从具有NADPH反应的那些孔的值中减去。

图1. Amplite™比色NADP / NADPH比率分析试剂盒用于使用SpectraMax酶标仪（Molecular devices）测量白色/透明96孔微量培养板中的总NADP / NADPH量和NADP / NADPH比率。

A-总NADPH和NADP剂量反应：孵育1小时可检测到低至0.03μM的总NADPH。

B-NADP / NADPH比例：用或不用NADP提取溶液处理等量的NADP和NADPH混合物15分钟，然后在室温下用提取溶液中和。 在460nm读取信号。 NADP / NADPH摩尔比基于图1B中所示的吸光度计算。

 

附录：使用组分G（NAD / NADH裂解缓冲液）的测试样品制剂

1.植物细胞样品：

用裂解缓冲液以200mg / mL均化，并以2500rpm离心5-10分钟，使用上清液进行测试。

 

2.样品：

离心收集细胞（（10,000 g，0°C，15 min）。使用约1亿至1千万细胞/ mL裂解缓冲液，将处理后的溶液在室温下保持15分钟。以2500 rpm离心5分钟， 用上清液进行试验。

 

3.哺乳动物细胞样本：

从平板孔中取出培养基，每1-5百万个细胞使用约100μL裂解缓冲液（或在96孔细胞培养板中使用50-100μL/孔），并将处理过的溶液在室温下保持15分钟。 直接使用细胞裂解液或以1500 rpm离心5分钟，使用上清液进行测试。

 

4.组织样品：

称取约20mg组织，用冷PBS洗涤。 在微量离心管中用400μl裂解缓冲液均化。 以2500rpm离心5-10分钟，使用上清液进行测定。

 

试剂应用文献

Impact of Genetic Reduction of NMNAT2 on Chemotherapy-Induced Losses in Cell Viability In Vitro and Peripheral Neuropathy In Vivo
Authors: Slivicki, Richard A and Ali, Yousuf O and Lu, Hui-Chen and Hohmann, Andrea G
Journal: PloS one (2016): e0147620

NMNAT2: HSP90 Complex Mediates Proteostasis in Proteinopathies
Authors: Ali, Yousuf O and Allen, Hunter M and Yu, Lei and Li-Kroeger, David and Bakhshizadehmahmoudi, Dena and Hatcher, Asante and McCabe, Cristin and Xu, Jishu and Bjorklund, Nicole and Taglialatela, Giulio and others
Journal: PLoS Biol (2016): e1002472

ACLY and ACC1 Regulate Hypoxia-Induced Apoptosis by Modulating ETV4 via α-ketoglutarate
Authors: Keenan, Melissa M and Liu, Beiyu and Tang, Xiaohu and Wu, Jianli and Cyr, Derek and Stevens, Robert D and Ilkayeva, Olga and Huang, Zhiqing and Tollini, Laura A and Murphy, Susan K and others
Journal: PLoS Genet (2015): e1005599

Analysis of the nicotinamide phosphoribosyltransferase family provides insight into vertebrate adaptation to different oxygen levels during the water-to-land transition
Authors: Fang, Chengchi and Guan, Lihong and Zhong, Zaixuan and Gan, Xiaoni and He, Shunping
Journal: FEBS journal (2015): 2858--2878

Metformin-induced energy deficiency leads to the inhibition of lipogenesis in prostate cancer cells
Authors: Loubière, Camille and Goiran, Thomas and Laurent, Kathiane and Djabari, Zied and Tanti, Jean-Frančois and Bost, Frédéric
Journal: Oncotarget (2015): 15652

Prediction of intracellular metabolic states from extracellular metabolomic data
Authors: Aurich, Maike K and Paglia, Giuseppe and Rolfsson, Ottar and Hrafnsdóttir, Sigrún and Magnúsdóttir, Manuela and Stefaniak, Magdalena M and Palsson, Bernhard O and Fleming, Ronan MT and Thiele, Ines
Journal: Metabolomics (2015): 603--619

 

参考文献

Enhanced metabolic activities for ATP production and elevated metabolic flux via pentose phosphate pathway contribute for better CIK cells expansion
Authors: Weiwei Zhang, Huimin Huang, Haibo Cai, Wen-Song Tan
Journal: Cell proliferation (2019)

Soluble α-Klotho treatment protects adenine-induced uremia rats from sciatic nerve damage
Authors: Yingdan Zhao, Jun Ma, Bo Gu, Yang Yi, Hanqing Wang, Zhiyong Guo
Journal: Biomedical Research (2018)

Celastrol attenuates angiotensin II mediated human umbilical vein endothelial cells damage through activation of Nrf2/ERK1/2/Nox2 signal pathway
Authors: Miao Li, Xin Liu, Yongpeng He, Qingyin Zheng, Min Wang, Yu Wu, Yuanpeng Zhang, Chaoyun Wang
Journal: European Journal of Pharmacology (2017): 124--133

Cytosolic Redox Status of Wine Yeast (Saccharomyces Cerevisiae) under Hyperosmotic Stress during Icewine Fermentation
Authors: Fei Yang, Caitlin Heit, Debra L Inglis
Journal: Fermentation (2017): 61

Epigenetic regulation of Runx2 transcription and osteoblast differentiation by nicotinamide phosphoribosyltransferase
Authors: Min Ling, Peixin Huang, Shamima Islam, Daniel P Heruth, Xuanan Li, Li Qin Zhang, Ding-You Li, Zhaohui Hu, Shui Qing Ye
Journal: Cell & Bioscience (2017): 27

MCU-dependent mitochondrial Ca2+ inhibits NAD+/SIRT3/SOD2 pathway to promote ROS production and metastasis of HCC cells
Authors: T Ren, H Zhang, J Wang, J Zhu, M Jin, Y Wu, X Guo, L Ji, Q Huang, H Yang
Journal: Oncogene (2017)

Metabolic and molecular insights into an essential role of nicotinamide phosphoribosyltransferase
Authors: Li Q Zhang, Leon Van Haandel, Min Xiong, Peixin Huang, Daniel P Heruth, Charlie Bi, Roger Gaedigk, Xun Jiang, Ding-You Li, Gerald Wyckoff
Journal: Cell Death & Disease (2017): e2705

Pyrroloquinoline Quinone, a Redox-active o-Quinone, Stimulates Mitochondrial Biogenesis by Activating SIRT1/PGC-1α Signaling Pathway
Authors: Kazuhiro Saihara, Ryosuke Kamikubo, Kazuto Ikemoto, Koji Uchida, Mitsugu Akagawa
Journal: Biochemistry (2017)

Resveratrol attenuates excessive ethanol exposure induced insulin resistance in rats via improving NAD+/NADH ratio
Authors: Gang Luo, Bingqing Huang, Xiang Qiu, Lin Xiao, Ning Wang, Qin Gao, Wei Yang, Liping Hao
Journal: Molecular Nutrition & Food Research (2017)

A Snapshot of the Plant Glycated Proteome STRUCTURAL, FUNCTIONAL, AND MECHANISTIC ASPECTS
Authors: Tatiana Bilova, Elena Lukasheva, Dominic Brauch, Uta Greifenhagen, Gagan Paudel, Elena Tarakhovskaya, Nadezhda Frolova, Juliane Mittasch, Gerd Ulrich Balcke, Alain Tissier
Journal: Journal of Biological Chemistry (2016): 7621--7636

 

相关产品

产品名称	货号
Amplite NAD/NADH比率检测试剂盒(比色法)	Cat#15273
Amplite NADP/NADPH比率检测试剂盒（荧光法） 红色荧光	Cat#15264
Amplite NADPH检测试剂盒(比色法)	Cat#15272