Amplite NAD/NADH比率检测试剂盒(比色法)

Amplite NAD/NADH比率检测试剂盒（比色法）是美国AAT Bioquest研发的检测NAD/NADH的试剂盒，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADP）是细胞中发现的两种重要的辅酶。 NAD形成NADP，通过酯键将磷酸基团添加到腺苷核苷酸的2'位置。 NADH（NADPH）是NAD（NADP）的还原形式，NAD（NADP）是NADH（NADPH）的氧化形式。 NAD或NADP在氧化还原反应中起辅助因子的作用，在细胞反应中转移电子。 氧化形式和还原形式之间的平衡是NAD / NADH（NADP / NADPH）比率。 该比率是指示细胞氧化还原状态的重要组分，并且它是反映代谢活性和细胞健康的测量。 在健康的哺乳动物组织中，游离NAD +和NADH之间的比率的估计可以高达700.相反，NADP / NADPH比率通常为约0.005，因此NADPH是该辅酶的主要形式。

该Amplite 比色NAD / NADH比率分析试剂盒提供了一种比色法，用于测量培养细胞中细胞内总NAD / NADH量和NAD / NADH比率。 在该测定中，裂解物中的NAD可以用NAD提取溶液提取并通过酶反应转化为NADH，然后通过NADH探针识别，在反应后得到黄色染料，其在460nm处具有吸光度。 产生的染料量与细胞裂解物中NAD或NADH的浓度成正比，可用作细胞NAD / NADH浓度的指示剂。百萤生物是AAT Bioquest的中国代理商，为您提供优质的NAD/NADH检测试剂盒。 

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吸光度酶标仪
吸光度:	460 nm
推荐孔板:	透明底板

96孔板检测示例

概述

准备25μLNADH标准品和/或测试样品在室温下

加入25μLNAD提取液孵育15分钟

加入25μL中和溶液加入75μLNAD/ NADH反应混合物在

室温下孵育15分钟至2小时

监测 在460nm处的吸光度

注意：在开始实验之前，在室温下解冻每个试剂盒组分中的一个。

 

操作步骤

1.准备NADH储备溶液：

将200μLPBS缓冲液加入到NADH标准品（组分C）的小瓶中，得到1mM（1nmol / L）NADH储备溶液。

注意：未使用的NADH储备溶液应分成单次使用的等分试样并储存在-20℃。

 

2.准备NAD / NADH反应混合物：

2.1将8 mL NADH探针缓冲液（组分B-II）加入到NAD / NADH回收酶混合物（组分A）的瓶中，并充分混合。

2.2将2 mL NADH探针（组分B-I）加入上述瓶中（来自步骤2.1）并充分混合。

注意：这种NAD / NADH反应混合物足以进行125~200次分析。 未使用的NAD / NADH反应混合物应分成一次性等分试样并储存在-20℃。

 

3.准备连续稀释的NADH标准品（0至10μM）：

3.1将10μL1mMNADH储备溶液（来自步骤1）加入990L PBS缓冲液（pH7.4）中，得到10μM（10pmol / L）NADH标准溶液。

注意：稀释的NADH标准溶液不稳定，应在4小时内使用。

3.2取200μL10M NADH标准溶液（来自步骤3.1）进行1：2连续稀释，得到5,2.5,1.25,0.625,0.313,0.156,0.078和0 M系列稀释的NADH标准品。

 

4.运行总NAD / NADH分析（总共400个分析/试剂盒）：

4.1如表1和2中所述，将含有NADH标准品和含NAD / NADH的测试样品的系列稀释液加入白色/透明底96孔微孔板中。

注意：根据需要准备细胞或组织样本NAD / NADH裂解缓冲液（组分G）可用于裂解细胞（详见附录）。

 

表1.白色/透明底96孔微孔板中NADH标准品和测试样品的布局

BL	BL	TS	TS
NS1	NS1	….	….
NS2	NS2
NS3	NS3
NS4	NS4
NS5	NS5
NS6	NS6
NS7	NS7

注意：NS = NADH标准，BL =空白对照，TS =测试样品

 

表2.每个孔的试剂组成

NADH Standard	Blank Control	Test Sample
Serial Dilutions*: 50 μL	PBS: 50 μL	50 μL

*注意：将连续稀释的NADH标准品（0.078μM至5μM）加入NS1至NS7的孔中，一式两份。 高浓度的NADH（例如，>100μM，最终浓度）将导致饱和信号并使校准曲线非线性。

 

4.2将50μLNAD/ NADH反应混合物（来自步骤2.2）加入NADH标准品，空白对照和测试样品（来自步骤4.1）的每个孔中，以使总NAD / NADH测定体积为100μL/孔。

4.3在室温下孵育反应15分钟至2小时，避光。

4.4使用吸光度读板仪在460 nm处检测吸光度的增加。

 

5.运行NAD / NADH比率分析（总共250个分析/试剂盒）：

5.1如表3和4中所述，将连续稀释的NADH标准品和/或含NAD / NADH的测试样品加入白色/透明96孔微孔板中。

注意：根据需要准备细胞或组织样本。 为方便起见，裂解缓冲液（组分G）可用于裂解细胞（详见附录）。

 

表3.白色/透明96孔微孔板中NADH标准品和测试样品的布局

BL	BL	TS	TS	TS (NAD)	TS (NAD)
NS1	NS1	….	….	….	….
NS2	NS2
NS3	NS3
NS4	NS4
NS5	NS5
NS6	NS6
NS7	NS7

注意：NS = NAD / NADH标准; BL =空白对照; TS =测试样品; TS（NAD）=用NAD提取溶液（组分D）处理10至15分钟的测试样品，然后用中和溶液（组分E）中和。

 

表4.每个孔的试剂组合物

NADH Standard	Blank Control	Test Sample (NAD/NADH)	Test Sample (NAD Extract)
Serial Dilutions*: 25 μL	PBS: 25 μL	Test Sample: 25 μL	Test Sample: 25 μL
Component F: 25 μL	Component F: 25 μL	Component F: 25 μL	Component D: 25 μL
Incubate at room temperature for 10 to 15 minutes
Component F: 25 μL	Component F: 25 μL	Component F: 25 μL	Component E: 25 μL
Total: 75 μL	Total: 75 μL	Total: 75 μL	Total: 75 μL

*注意：将连续稀释的NADH标准品（0.078μM至5μM）加入NS1至NS7的孔中，一式两份。 高浓度的NADH（例如，>100μM，最终浓度）将导致饱和信号并使校准曲线非线性。

 

5.2对于NAD提取（NAD量）：将25μLNAD提取溶液（组分D）加入含有NAD / NADH的测试样品的孔中。在室温下孵育10至15分钟，然后加入25μLNADH中和溶液（组分E）以中和NAD提取物，如表3和4中所述。

对于总NAD和NADH（总量）：将25μLNAD/ NADH对照溶液（组分F）加入NADH标准品和含有NAD / NADH的测试样品的孔中。在室温下孵育10至15分钟，然后如表3和4中所述添加25μL提取对照溶液（组分F）。

注意：根据需要准备细胞或组织样本。裂解缓冲液（组分G）可用于裂解细胞（详见附录）。

5.3将75μL的NADH反应混合物（来自步骤2.2）加入NADH标准品，空白对照和测试样品（NAD / NADH和NAD提取物）（来自步骤5.1）的每个孔中，使总NADH测定体积为150μL /好。

5.4在室温下孵育反应15分钟至2小时，避光。

5.5使用吸光度读板仪在460 nm处检测吸光度的增加。

 

数据分析

        空白孔（仅PBS缓冲液）中的吸光度用作对照，并从具有NADH反应的那些孔的值中减去。

图1. Amplite™比色NAD / NADH比率分析试剂盒用于使用SpectraMax酶标仪（Molecular devices）测量白色/透明96孔微孔板中的总NAD / NADH量和NAD / NADH比率。

A-总NADH和NAD剂量反应：孵育1小时可检测到低至0.1μM的总NADH。

B-NAD / NADH比：在有或没有NAD提取溶液的情况下处理等量的NAD和NADH混合物15分钟，然后在室温下用提取溶液中和。 在460nm读取信号。 基于图1B中所示的吸光度计算NAD / NADH摩尔比。

 

附录：使用组分D（裂解缓冲液）的测试样品制剂

1.植物细胞样品：用200mg / mL的裂解缓冲液均质化，并以2500rpm离心5-10分钟，使用上清液进行测试。

2.细胞样品：离心收集细胞（（10,000 g，0°C，15 min）。使用约1亿至1千万细胞/ mL裂解缓冲液，将处理后的溶液在室温下保持15分钟.2500℃离心 转速5分钟，并用上清液进行试验。

3.哺乳动物细胞样品：从平板孔中取出培养基，每1-5百万个细胞使用约100μL裂解缓冲液（或在96孔细胞培养板中使用50-100μL/孔），并将处理过的溶液保持在室温下 15分钟。 直接使用细胞裂解液或以1500 rpm离心5分钟，使用上清液进行测试。

4.组织样品：称取约20mg组织，用冷PBS洗涤。 在微量离心管中用400μl裂解缓冲液均化。 以2500rpm离心5-10分钟，使用上清液进行测定。

 

参考文献

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Authors: Fei Yang, Caitlin Heit, Debra L Inglis
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