Amplite NADH 和 NADPH 检测试剂盒(比色法)

Amplite NADH 和 NADPH 检测试剂盒(比色法)是美国AAT Bioquest研发的检测NADPH的试剂盒，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD +）和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADP +）是细胞中发现的两种重要的辅因子。 NADH是NAD +的还原形式。 NAD形成NADP，通过酯键将磷酸基团添加到腺苷核苷酸的2'位置。传统的NAD / NADH和NADP / NADPH测定基于监测340nm处NADH或NADPH吸收的变化。 NAD / NADH和NADP / NADPH测定的短紫外波长使得传统方法具有低灵敏度和高干扰。 AAT Bioquest的Amplite 比色NADPH检测试剂盒为检测NADPH提供了一种便捷的方法。 NADPH探针是一种生色传感器，在NADPH减少时具有460nm的大吸光度。 NADPH探针的吸收与溶液中NADPH的浓度成正比。 Amplite 比色NADPH检测试剂盒提供灵敏的检测方法，可在100μL检测体积中检测低至3μM的NADPH。百萤生物是AAT Bioquest的中国代理商，为您提供优质的NADH检测试剂盒。 

96孔板检测示例

概述

准备NADPH反应混合物（50μL）

加入NADPH标准品或测试样品（50μL）

在室温孵育或15分钟至2小时

孵育460 nm处的监测吸光度

注意：在开始实验之前，在室温下解冻每个试剂盒组分中的一个。

 

操作步骤

1.准备NADPH原液：

将200μLPBS缓冲液加入到NADPH标准品（组分C）的小瓶中以制备1mM（1nmol / L）NADH储备溶液。

注意：未使用的NADH储备溶液应分成单次使用的等分试样并储存在-20℃。

 

2.准备NADPH反应混合物：

将1mL NADPH探针（组分A）加入4mL NADPH测定缓冲液（组分B）中，并充分混合。

注意：5mL NADPH反应混合物用于一个96孔。 未使用的NADPH反应混合物应分成单次使用的等分试样并储存在-20℃。

 

3.准备NADPH标准品的连续稀释液（0至100μM）：

3.1将100μLNADPH储备溶液（来自步骤1）加入400μLPBS缓冲液（pH 7.4）中，以产生200μM（100pmol / L）NADPH标准溶液。

注意：稀释的NADPH标准溶液不稳定，应在4小时内使用。

3.2取200μL的200μMNADPH标准溶液进行1：2连续稀释，得到NADPH标准品的100,50,25,12.5,6.25,3.13和0μM连续稀释液。

如表1和2中所述，将NADPH标准品和含有NADPH的测试样品的系列稀释液加入白色/透明底96孔微量培养板中。

注意：根据需要制备细胞或组织样品。 为方便起见，裂解缓冲液（组分D）可用于裂解细胞（详见附录）。

 

表1在白色/透明底96孔微孔板中的NADPH标准品和测试样品的布局

BL	BL	TS	TS
NS1	NS1	...	...
NS2	NS2
NS3	NS3
NS4	NS4
NS5	NS5
NS6	NS6
NS7	NS7

注意：NS = NADPH标准，BL =空白对照，TS =测试样品

 

表2每个孔的试剂组成

NADPH	空白对照	测试样
连续稀释：50 ul	PBS:50 ul	50 ul

*注意：将连续稀释的NADPH标准品（3.13μM至200μM）加入NS1至NS7的孔中，一式两份

 

4.在上清液反应中运行NADPH测定：

4.1将50μLNADPH反应混合物（来自步骤2）加入NADPH标准品，空白对照和测试样品的每个孔中（参见步骤3.3），使总NADPH测定体积为100μL/孔

注1：对于384孔板，每孔加入25μL样品和25μLNADPH反应混合物。

注2：根据需要准备细胞或组织样本。 为方便起见，裂解缓冲液（组分D）可用于裂解细胞（详见附录）。

4.2在室温下孵育反应15分钟至2小时，避光。

4.3用吸光度读板仪在460 nm处检测吸光度的增加。

 

数据分析

        空白孔中的吸光度（仅用PBS缓冲液）用作对照，并从具有NADPH反应的那些孔的值中减去.NADPH标准曲线如图1所示。

图1使用SpectraMax酶标仪（Molecular devices），在96孔白色/透明底板中用Amplite 比色NADPH测定试剂盒测量NADPH剂量反应。 孵育30分钟（n = 3）可以检测到低至3μM的NAPDH，在460nm处测量吸光度。

 

附录：使用组分D（裂解缓冲液）的测试样品制剂

1.植物细胞样品：用200mg / mL的裂解缓冲液均质化，并以2500rpm离心5-10分钟，使用上清液进行测试。

2.细胞样品：离心收集细胞（（10,000 g，0°C，15 min）。使用约1亿至1千万细胞/ mL裂解缓冲液，将处理后的溶液在室温下保持15分钟.2500℃离心 转速5分钟，并用上清液进行试验。

3.哺乳动物细胞样品：从平板孔中取出培养基，每1-5百万个细胞使用约100μL裂解缓冲液（或在96孔细胞培养板中使用50-100μL/孔），并将处理过的溶液保持在室温下 15分钟。 直接使用细胞裂解液或以1500 rpm离心5分钟，使用上清液进行测试。

4.组织样品：称取约20mg组织，用冷PBS洗涤。 在微量离心管中用400μl裂解缓冲液均化。 以2500rpm离心5-10分钟，使用上清液进行测定。

 

参考文献

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