Amplite 比色法黄嘌呤检测试剂盒

Amplite 比色法黄嘌呤检测试剂盒是美国AAT Bioquest生产的用于检测黄嘌呤的试剂盒，黄嘌呤是在大多数人体组织和液体中发现的嘌呤碱。 许多兴奋剂来源于黄嘌呤，包括咖啡因，氨茶碱，IBMX，旁黄嘌呤，己酮可可碱，可可碱和茶碱，它们可以刺激心率，收缩力，高浓度的心律失常。 因此，检测生物样品中的黄嘌呤变化对于疾病诊断和监测是重要的。 Amplite 比色黄嘌呤测定试剂盒为测量黄嘌呤提供了一种快速且超灵敏的方法。 它可以用方便的96孔或384孔微量滴定板格式进行。 黄嘌呤在黄嘌呤氧化酶存在下氧化成尿酸释放过氧化氢，用吸光度酶标仪在576nm处用Amplite Red进行特异性测定。 使用Amplite 比色黄嘌呤测定试剂盒，在100μL反应体积中检测到低至1.2μM的黄嘌呤。百萤生物是AAT Bioquest的中国代理商，为您提供优质的Amplite 比色法黄嘌呤检测试剂盒。 

 

适用仪器

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光吸收酶标仪
吸收:	570/610nm
推荐孔板:	透明底板

样品实验方案

简要概述

1.准备黄嘌呤标准品和测试样品（50 µL）
2.添加黄嘌呤工作溶液（50 µL）
3.在室温下孵育30-60分钟
4.OD比为570/610 nm时读取吸光度增加

 

溶液配制

1.储存溶液配制

所有未使用的储备溶液应分为一次性使用的等分试样，并在制备后储存在-20°C下。避免重复冻融循环。
1.1 Amplite 红色底物储备液（250X）：
在Amplite 红色底物（组分A）的小瓶中加入40 µL DMSO（组分F）。注意：Amplite 红色底物在硫醇（如二硫苏糖醇（DTT）和2-巯基乙醇）的存在下不稳定。反应中DTT或2-巯基乙醇的终浓度应不高于10 µM。由于Amplite Red的pH不稳定> 8.5，因此应在pH 7 – 8（建议pH 7.4）下进行测定。

1.2 HRP储备溶液（500X）：
将100 µL测定缓冲液（组分B）加到辣根过氧化物酶（组分C）小瓶中。

1.3 黄嘌呤氧化酶（XO）储备溶液（100X）：
向小瓶黄嘌呤氧化酶标准品（组分E）中添加100 µL测定缓冲液（组分B），制成黄嘌呤氧化酶（XO）储备液（100X）。

1.4 黄嘌呤标准溶液（100 µM）：
将5 µL黄嘌呤标准品（组分D）添加到995 µL测定缓冲液（组分B）中，得到100 µM黄嘌呤标准溶液。

 

2.标准溶液配制

黄嘌呤标准品
用100 µM黄嘌呤标准溶液（X7）进行1：3系列稀释，以获得黄嘌呤标准液（X6-X1）。

 

3.工作溶液配制

将20μL的Amplite Red底物储备液（250X），10μL的HRP储备液（500X）和50μL的黄嘌呤氧化酶储备液（100X）加入5 mL的测定缓冲液中，使总体积为5.08 mL，避光。

 

样品操作及实验分析

表1.在透明的底部96孔微孔板（50 µL /孔）中的黄嘌呤标准品和测试样品的布局。 X =黄嘌呤标准品（X1-X7，0.1至100 µM），BL =空白对照，TS =测试样品。

BL	BL	TS	TS
X1	X1	...	...
X2	X2	...	...
X3	X3
X4	X4
X5	X5
X6	X6
X7	X7

表2.每个孔的试剂组成

孔	容积	试剂
X1-X7	50ul	连续稀释液（0.1至100 µM）
BL	50ul	分析缓冲液（组分B）
TS	50ul	测试样品

1.根据表1和2中提供的布局，准备黄嘌呤标准品（X），空白对照（BL）和测试样品（TS）。对于384孔板，每孔使用25 µL试剂代替50 µL。

2.向黄嘌呤标准品，空白对照和测试样品的每个孔中添加50 µL工作溶液，以使黄嘌呤测定总体积为100 µL /孔。 对于384孔板，请向每个孔中添加25 µL工作溶液，总体积为50 µL /孔。

3.在避光条件下，于室温下孵育反应30至60分钟。

4.使用吸光度板读数器以570/610 nm的OD比监视信号强度。

 

参考文献

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