Amplite 荧光法过氧化酶检测试剂盒 红色荧光

Amplite 荧光法过氧化酶检测试剂盒是美国AAT Bioquest生产的用于过氧化物酶的试剂盒，过氧化酶是常用于与抗体按4:1比例结合的小分子(MW ~40 KD)。由于分子量小，因此在与抗体、抗原结合形成复合物时不会带来空间阻碍。与其它酶标签相比，过氧化酶也更便宜；其主要缺点是在保护剂（例如叠氮化钠）存在的条件下溶解性低；而在低浓度下，过氧化酶的活性低。HRP偶联物是广泛用作ELISA（酶联免疫吸附实验）、免疫组化技术、Northern、 Southern和Western blot分析的第二个检测试剂。Amplite比色法过氧化酶检测试剂盒 *蓝色* 提供了一种快速(10分钟)HRP一步法均质的、无需洗脱的分析方案。本试剂盒使用Amplite Blue，我们的超灵敏HRP显色底物，即Amplite Blue作为过氧化酶的显色底物，它比双氧水和过氧化酶及其它的过氧化酶的显色底物（例如TMB, ABTS, OPD 和K-Blue）具有更高的灵敏度。Amplite Blue产生高吸收物质，在664nm处有大吸收峰。这种近红外吸收使自动化检测生物样品时本底吸收很小。本试剂盒可以用于ELISA，酶促反应动力学分析，氧化酶抑制剂高通量筛选等。试剂盒经过优化处理，并且可用于高通量液体处理设备。百萤生物是AAT Bioquest的中国代理商，为您提供优质的Amplite 荧光法过氧化酶检测试剂盒。 

 

适用仪器

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光吸收酶标仪
吸收:	576 ± 5nm
推荐孔板:	透明底板
荧光酶标仪
Ex:	540nm
Em:	590nm
Cutoff:	575nm
推荐孔板:	纯黑色孔板

样品实验方案

简要概述

1.准备HRP工作溶液（50μL）
2.添加HRP标准品和/或测试样品（50μL）
3.在室温下孵育10-30分钟
4.监测664±5 nm的吸光度

 

溶液制备 

1.储备溶液

所有未使用的储备溶液应分成一次性等分试样，并在制备后储存在-20°C。 避免反复冻融循环。
1. Amplite 红色过氧化物酶底物储备液（100X）：
将250μLDMSO（组分E）加入到Amplite 红色过氧化物酶底物（组分A）的小瓶中以制备100X Amplite 红色过氧化物酶底物储备溶液。 应立即使用原液，避光。

2. HRP标准溶液（20 U / mL）：
将1mL测定缓冲液（组分C）加入到辣根过氧化物酶（组分D）的小瓶中以制备20U / mL的HRP标准溶液。

3. H₂O₂储备溶液（20 mM）：
将22.7μL的3％H₂O₂（0.88M，组分B）加入977μL的测定缓冲液（组分C）中以制备20mM H₂O₂储备溶液。 注意：稀释的H₂O₂溶液不稳定。 应丢弃未使用的部分。

 

2.标准溶液

HRP标准
在1999μL分析缓冲液（组分C）中加入1μL的20U / mL HRP标准溶液，得到10mU / mL HRP标准溶液（SD7）。 取10 mU / mL HRP标准溶液（SD7）并进行1：3连续稀释，得到连续稀释的HRP标准品（SD6-SD1）和分析缓冲液（组分C）。

 

3.工作溶液

将50μL的100X Amplite 红色过氧化物酶底物储备溶液和50μL的20mM H₂O₂储备溶液加入到4.9mL的测定缓冲液（组分C）中以制备HRP工作溶液，避光。

 

样品分析

表1.实心黑色96孔微孔板中HRP标准品和测试样品的布局。 SD = HRP标准品（SD1-SD7,0.01至10 mU / mL）; BL =空白对照; TS =测试样品。

BL	BL	TS	TS
SD1	SD1	...	...
SD2	SD2	...	...
SD3	SD3
SD4	SD4
SD5	SD5
SD6	SD6
SD7	SD7

表2.每个孔的试剂组成

孔	容积	试剂
SD1-SD7	50ul	连续稀释液（0.01至10 mU / mL）
BL	50ul	分析缓冲液（组分C）
TS	50ul	测试样品

1.根据表1和2中提供的布局制备HRP标准品（SD），空白对照品（BL）和测试样品（TS）。对于384孔板，每孔使用25μL试剂代替50μL。注意：高水平的HRP（例如，> 100mU / mL终浓度）可能由于Amplite TM Red（至非荧光）的过度氧化而导致荧光信号降低。

2.向HRP标准品，空白对照和测试样品的每个孔中加入50μLHRP工作溶液，使总HRP测定体积为100μL/孔。对于384孔板，在每个孔中加入25μLHRP工作溶液，总体积为50μL/孔。

3.在室温下孵育反应10至30分钟，避光。

4.用荧光板读数器在激发= 540±10nm，发射= 590±10nm（佳Ex / Em = 540 / 590nm，截止= 575nm）监测荧光增加。注意：也可以将板的内容物转移到白色透明底板上，并用吸光度酶标仪在576±5nm的波长下读数。与荧光读数相比，吸收检测具有较低的灵敏度。

 

参考文献

Identification of acetylcholinesterase inhibitors using homogenous cell-based assays in quantitative high-throughput screening platforms
Authors: Shuaizhang Li, Ruili Huang, Samuel Solomon, Yitong Liu, Bin Zhao, Michael F Santillo, Menghang Xia
Journal: Biotechnology journal (2017): 1600715

 

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