Amplite 荧光法过氧化氢检测试剂盒 近红外荧光

Amplite 荧光法过氧化氢检测试剂盒 近红外荧光 是美国AAT Bioquest生产的用于检测过氧化氢的试剂盒，过氧化氢（H₂O₂）是一种活性氧代谢副产物，可作为许多氧化应激相关状态的关键调节剂。它涉及许多，动脉粥样硬化，糖尿病血管病变，骨质疏松症，一些神经退行性疾病和唐氏综合症有关的生物学事件。也许H₂O₂生物学有趣的方面是近的报告，即抗体具有将分子氧转化为过氧化氢的能力，有助于免疫系统的正常识别和破坏过程。测量这种活性物质将有助于确定氧化应激如何调节各种细胞内途径。

这种Amplite 荧光过氧化氢测定试剂盒使用我们的非荧光Amplite 红色过氧化物酶底物来量化溶液和细胞提取物中的过氧化氢。它还可用于通过酶偶联反应检测多种氧化酶活性。该试剂盒是一种优化的“混合和读数”分析，与HTS液体处理仪器兼容。它提供灵敏的一步荧光测定法，可在100μL测定体积（30 nM，图1）中检测少至3皮摩尔的H₂O₂。该测定可以以方便的96孔或384孔微量滴定板形式进行，并且易于适应自动化。 其信号可通过Ex / Em = ~540 / 590 nm的荧光酶标仪或~570 nm的吸光度酶标仪轻松读取。百萤生物是AAT Bioquest的中国代理商，为您提供优质的Amplite 荧光法过氧化氢检测试剂盒。

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适用仪器

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荧光酶标仪
Ex:	640nm
Em:	680nm
Cutoff:	665nm
推荐孔板:	纯黑色孔板

96孔板的测定方案

概述

准备H₂O₂反应混合物（50μL）

加入H₂O₂标准品或测试样品（50μL）

在室温下孵育10-30分钟在Ex / Em = 540/590 nm处监测荧光强度

注意：在开始实验之前，在室温下解冻所有试剂盒组分。

 

操作方法

1.准备库存解决方案：

1.1100X Amplite 红色过氧化物酶底物原液：将250μLDMSO（组分E）加入到Amplite 红色底物（组分A）的小瓶中。 应及时使用原液; 任何剩余的溶液应等分并在-20℃重新冷冻。

注意：避免反复冻融循环并避免光照。

1.220U / mL过氧化物酶储备溶液：将1mL测定缓冲液（组分C）加入到辣根过氧化物酶（组分D）的小瓶中。

注意：未使用的HRP溶液应分成单次使用的等分试样并储存在-20 ℃。

1.320mM H₂O₂储备溶液：将22.7L的3％H₂O₂（0.88M，组分B）加入977L的测定缓冲液（组分C）中。

注意：稀释的H₂O₂溶液不稳定。 应丢弃未使用的部分。

 

2.准备H₂O₂反应混合物：

 

3.准备H₂O₂标准品（0至10μM）的连续稀释液：

注意1：在存硫醇如DTT和β-巯基乙醇的情况下，组分A不稳定。 高于10M（终浓度）的硫醇将显着降低测定动态范围。

注意2：NADH和谷胱甘肽（还原形式：GSH）可能会干扰检测。

3.1将1μL20mM H₂O₂溶液（来自步骤1.3）加入1999μL测定缓冲液（组分C）中，得到10μMH₂O₂标准品。

3.2取200μL10μMH₂O₂标准品进行1：3连续稀释，得到3，1,0.3,0.1,0.03,0.01和0μMH₂O₂标准品系列稀释液。

3.3如说明书中表2和3中所述，将H₂O₂标准品和含H₂O₂的测试样品的系列稀释液加入到固体黑色96孔微量培养板中。

 

4.在上清液反应中进行H₂O₂测定：

4.1将50μLH₂O₂反应混合物（来自步骤2）加入到H₂O₂标准品，空白对照和测试样品的每个孔中（参见步骤3.3），使总H₂O₂测定体积为100μL/孔。

注意：对于384孔板，每孔加入25μL样品和25μLH₂O₂反应混合物。

4.2在室温下孵育反应15至30分钟，避光。

4.3在Ex / Em = 540±10/590±10nm（佳Ex / Em = 540 / 590nm）下用荧光板读数器监测荧光增加。

注意：也可以将板的内容物转移到白色透明底板上，并用吸光度酶标仪在576±5nm的波长下读数。与荧光读数相比，吸收检测具有较低的灵敏度。

 

5.对细胞进行H₂O₂检测：

Amplite 荧光过氧化氢检测试剂盒可用于测量细胞中H₂O₂的释放。 以下是建议的协议，可以进行修改以满足特定的研究需求。

5.1 H2O2反应混合物应按步骤2制备，但分析缓冲液（组分C）应替换为细胞培养系统中使用的培养基。建议的培养基包括（a）Krebs Ringers磷酸盐缓冲液（KRPB）;（b）汉克斯平衡盐溶液（HBSS）; 或（c）无血清培养基。

5.2在96孔板（50-100μL/孔）中制备细胞，并根据需要细胞。

注意：包括阴性对照（单独培养基和非活化细胞）用于测量背景荧光。

5.3将50μLH₂O₂反应混合物（来自步骤5.1）加入到细胞和H₂O₂标准品的每个孔中（来自步骤3.3）

5.4在室温下孵育反应15至30分钟，避光。

5.5用Ex / Em = 540±10/590±10nm（佳Ex / Em = 540 / 590nm）的荧光板读数器监测荧光增加。

 

参考文献

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Dopamine-mediated oxidation of methionine 127 in α-synuclein causes cytotoxicity and oligomerization of α-synuclein
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Hydrogen peroxide stimulates the epithelial sodium channel through a phosphatidylinositide 3-kinase-dependent pathway
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