mFluor Violet 510 酸

AAT Bioquest的mFluor 染料专门针对多色流式细胞仪的应用而开发。这些染料具有较大的斯托克斯位移，并且可以通过流式细胞仪的激光线（例如405 nm，488 nm和633 nm）很好地激发。 mFluor Violet 510染料的荧光激发和发射最大值分别为〜405 nm和〜510 nm。 这些光谱特性使其成为Pacific Orange 标记染料的绝佳替代品。 mFluor Violet 510酸是稳定的，并且是制造各种mFluor Violet 510衍生物的常见前体。

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操作方法

注意：该标记方案是针对山羊抗小鼠IgG与mFluor 450 SE的缀合物开发的。 您需根据您的实际情况而定。

1.准备蛋白质储备溶液（溶液A）：

将100μL反应缓冲液（如1 M碳酸钠溶液或1 M磷酸盐缓冲液，pH~9.0）与900μL目标蛋白溶液（如抗体，蛋白质浓度> 2 mg / ml）混合至100μL，以得到1 mL蛋白质标记原液。

注1：蛋白质溶液（溶液A）的pH值应为8.5±0.5。如果蛋白质溶液的pH低于8.0，则使用1M碳酸氢钠溶液或1M pH 9.0磷酸盐缓冲液将pH调节至8.0-9.0的范围。

注2：蛋白质应溶解于pH7.2-7.4的1X磷酸盐缓冲盐水（PBS）中。如果蛋白质溶解在Tris或甘氨酸缓冲液中，则必须用pH7.2-7.4的1X PBS透析，以除去用于蛋白质沉淀的游离胺或铵盐（例如硫酸铵和乙酸铵）。

注3：不纯的抗体、稳定的牛血清蛋白（BSA）抗体或明胶不会被很好的标记，叠氮化钠或硫柳汞的存在也可能干扰缀合反应。可以通过透析或旋转柱除去叠氮化钠或硫柳汞，以获得极佳标记结果。

注4：如果蛋白质浓度低于2 mg / mL，则结合效率会显著降低。为获得极佳标记效率，建议最终蛋白质浓度范围为2-10 mg / mL。

 

2.准备染料储备溶液（溶液B）：

将无水DMSO加入到iFluor 染料SE小瓶中以制备10-20mM储备溶液。 通过移液或涡旋混合均匀。

注意：在开始缀合前准备染料储备溶液（溶液B），及时使用。 染料储备溶液的长期储存可降低染料活性。 溶液B可在冰箱中保存两周，避光保存。 避免冻融循环。

 

3.确定最佳染料/蛋白质比例（可选）：

注意：每种蛋白质都需要不同的染料/蛋白质比例，这也取决于染料的性质。蛋白质的过度标记可能影响其结合亲和力，而低染料/蛋白质比率的蛋白质缀合物会降低灵敏度。我们建议您通过使用连续不同量的标记染料溶液重复步骤4和5来实验确定最佳染料/蛋白质比率。通常，对于大多数染料 - 蛋白质缀合物，推荐使用4-6种染料/蛋白质。

3.1使用10：1摩尔比的溶液B（染料）/溶液A（蛋白质）作为起始点：将5μl染料储备溶液（溶液B，假设染料储备溶液为10 mM）加入到样品瓶中。蛋白质溶液（95μl溶液A）有效摇动。假设蛋白质浓度为10mg / mL并且蛋白质的分子量为~200KD，蛋白质的浓度为~0.05mM。

注意：蛋白质溶液中DMSO的浓度应<10％。

3.2运行缀合反应（参见下面的步骤4）。

3.3重复＃3.2，溶液B /溶液A的摩尔比为5：1;分别为15：1和20：1。

3.4使用预制的旋转柱纯化所需的缀合物。

3.5计算上述4种结合物的染料/蛋白质比（DOS）。

3.6检测上述4种结合物，确定最佳的染料/蛋白质比例，以扩大标记反应。

 

4.运行结合反应：

4.1有效加入适量的染料储备溶液（溶液B）到蛋白质溶液（溶液A）的小瓶中晃动。

注意：溶液B /溶液的最佳摩尔比由步骤3.6确定。如果跳过步骤3，我们建议使用10：1溶液B（染料）/溶液A（蛋白质）的摩尔比。

4.2继续在室温下旋转或摇动反应混合物30-60分钟。

 

5.纯化缀合物

以下方案是使用Sephadex G-25柱纯化染料 - 蛋白质缀合物的实例。

5.1按照说明书准备Sephadex G-25色谱柱。

5.2将反应混合物（直接从步骤4）加载到Sephadex G-25柱的顶部。

5.3样品在顶部树脂表面下方运行时立即加入PBS（pH 7.2-7.4）。

5.4向所需样品中加入更多PBS（pH 7.2-7.4）以完成色谱柱纯化。

注1：立即使用时，染料 - 蛋白质偶联物需要用染色缓冲液稀释，并等分多次使用。

注2：对于长期储存，染料 - 蛋白质缀合物溶液需要浓缩或冷冻干燥。

 

参考文献

Deep Sequencing Analysis of the Eha-Regulated Transcriptome of Edwardsiella tarda Following Acidification
Authors: D Gao, N Liu, Y Li, Y Zhang, G Liu
Journal: Metabolomics (Los Angel) (2017): 2153--0769

Suramin inhibits cullin-RING E3 ubiquitin ligases
Authors: Kenneth Wu, Robert A Chong, Qing Yu, Jin Bai, Donald E Spratt, Kevin Ching, Chan Lee, Haibin Miao, Inger Tappin, Jerard Hurwitz
Journal: Proceedings of the National Academy of Sciences (2016): E2011--E2018

Glycosaminoglycan mimicry by COAM reduces melanoma growth through chemokine induction and function
Authors: Helene Piccard, Nele Berghmans, Eva Korpos, Chris Dillen, Ilse Van Aelst, Sandra Li, Erik Martens, Sandra Liekens, Sam Noppen, Jo Van Damme
Journal: International Journal of Cancer (2012): E425--E436

 

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