Amplite 荧光法乙酰胆碱检测试剂盒 红色荧光

Amplite 荧光法乙酰胆碱检测试剂盒是美国AAT Bioquest生产的用于检测乙酰胆碱酯酶的试剂盒，胆碱是一种强有机碱，是卵磷脂的组成成分，也存在于神经鞘磷脂之中，是机体可变甲基的一个来源而作用于合成甲基的产物，同时又是乙酰胆碱的前体。乙酰胆碱（AcetylCholine,ACh）是一种神经递质，能特异性的作用于各类胆碱受体，在组织内迅速被胆碱酯酶破坏，其作用广泛，选择性不高。在神经细胞中，乙酰胆碱是由胆碱和乙酰辅酶A在胆碱乙酰移位酶（胆碱乙酰化酶）的催化作用下合成的。胆碱和乙酰胆碱在许多生物学过程中发挥重要的作用。Amplite乙酰胆碱检测试剂盒 *红色荧光* 为定量检测胆碱提供了一种灵敏的方法。本试剂盒使用Amplite Red对氧化酶介导的酶偶联反应产物胆碱进行定量检测。Amplite Red的红色荧光强度与胆碱的量成比例关系。百萤生物是AAT Bioquest的中国代理商，为您提供优质的Amplite 荧光法乙酰胆碱检测试剂盒。

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适用仪器

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荧光酶标仪
Ex:	540nm
Em:	590nm
Cutoff:	570nm
推荐孔板:	纯黑色孔板

样品实验方案

简要概述

1.准备ACh工作溶液（50μL）
2.添加ACh标准品或ACh测试样品（50μL）
3.在室温下孵育10-30分钟
4.监测Ex / Em = 540/590 nm处的荧光强度（截止= 570 nm）

 

溶液制备 

1.储备溶液

所有未使用的储备溶液应分成一次性等分试样，并在制备后储存在-20°C。 避免反复冻融循环。
1. Amplite 红色储备液（250X）：
将40μLDMSO（组分E）加入到Amplite Red（组分A）的小瓶中以制备250X Amplite Red原液。

2.乙酰胆碱标准溶液（50 mM）：
将200μLddH₂O加入到乙酰胆碱标准品（组分C）的小瓶中以制备50mM乙酰胆碱标准溶液。

 

2.标准溶液

乙酰胆碱标准
将20μL50mM乙酰胆碱标准溶液加入到980μL测定缓冲液（组分D）中以产生1000μM乙酰胆碱标准溶液。 取1000μM乙酰胆碱标准品，在分析缓冲液（组分D）中进行1:10，得到100μM乙酰胆碱标准品（AS7）。 取100μM乙酰胆碱标准品（AS7）和1：3连续稀释液，用分析缓冲液（组分D）连续稀释乙酰胆碱标准品（AS6-AS1）。 注意：稀释的乙酰胆碱标准溶液不稳定，应在4小时内使用。

 

3.工作溶液

1.将5mL测定缓冲液（组分D）加入乙酰胆碱探针（组分B）瓶中并充分混合。

2.将20μL250XAmplite Red 储备溶液加入乙酰胆碱探针溶液瓶中，制成乙酰胆碱（ACh）工作溶液。 注意：应立即使用乙酰胆碱（ACh）工作溶液并避光。 测定背景将随着更长的储存时间而增加。

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样品分析

表1.实心黑色96孔微孔板中乙酰胆碱标准品和测试样品的布局。 AS =乙酰胆碱标准品（AS1-AS7,0.14至100μM）; BL =空白对照; TS =测试样品。

BL	BL	TS	TS
AS1	AS1	...	...
AS2	AS2	...	...
AS3	AS3
AS4	AS4
AS5	AS5
AS6	AS6
AS7	AS7

表2.每个孔的试剂组成

孔	容积	试剂
AS1-AS7	50ul	连续稀释液（0.14至100μM）
BL	50ul	分析缓冲液
TS	50ul	测试样本

1.根据表1和2中提供的布局制备乙酰胆碱标准品（AS），空白对照（BL）和测试样品（TS）。对于384孔板，每孔使用25μL试剂代替50μL。 注意：根据需要处理细胞或组织样本。

2.向乙酰胆碱标准品，空白对照和测试样品的每个孔中加入50μL乙酰胆碱（ACh）工作溶液，使总乙酰胆碱测定体积为100μL/孔。 对于384孔板，在每个孔中加入25μL乙酰胆碱（ACh）工作溶液，总体积为50μL/孔。

3.在室温下孵育反应10至30分钟，避光。

4.用Ex / Em = 540 / 590nm（截止值= 570nm）的荧光酶标仪监测荧光增加。

 

参考文献

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