Amplite 荧光法黄嘌呤氧化酶检测试剂盒 红色荧光

Amplite 荧光法黄嘌呤氧化酶检测试剂盒是美国AAT Bioquest生产的谷氨酸检测的试剂盒，XO（黄嘌呤氧化酶）是一种能催化次黄嘌呤到黄嘌呤或者更进一步催化黄嘌呤到尿酸的酶。在嘌呤的分解代谢扮演着重要角色。XO通常能在肝脏或者空肠检测到。在重度肝损伤，XO释放到血液中，因此血液中XO检测试验可以用来确定肝脏损伤的发生。黄嘌呤尿是一种少见遗传病，缺少XO导致血中高浓度黄嘌呤引起肾衰竭等健康疾病。Amplite XO检测试剂盒提供了一种快速超敏感的方法，来检测XO的活性。本试剂盒可以用于96或384微孔板分析，并且无需任何分步骤，就可以轻易地实现自动化。在实验分析种，XO氧化嘌呤碱基，次黄嘌呤、黄嘌呤转变成尿酸或者超氧化物，后者又自发的降解为双氧水。该试剂盒使用我们的Amplite Red底物使其成为双记录模式。红色的荧光信号很容易的通过荧光酶标仪（540／590nm）检测到或者被酶标仪（576nm）检测。Amplite黄嘌呤氧化酶检测试剂盒在100 ul检测体积中能检测到0.15mU／ml的XO。百萤生物是AAT Bioquest的中国代理商，为您提供优质的Amplite 荧光法黄嘌呤氧化酶检测试剂盒。 

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适用仪器

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荧光酶标仪
Ex:	540nm
Em:	590nm
Cutoff:	570nm
推荐孔板:	纯黑色孔板

样品实验方案

简要概述

1.XO标准品或测试样品（50μL）
2.添加XO工作溶液（50μL）
3.在室温下孵育15-30分钟
4.在Ex / Em = 540/590 nm处读取荧光强度（截止570 nm）

 

溶液制备 

1.储备溶液

所有未使用的储备溶液应分成一次性等分试样，并在制备后储存在-20°C。避免反复冻融循环。
1. Amplite 红色储备液（250X）：
将40μLDMSO（组分F）加入到Amplite Red底物（组分A）的小瓶中。应立即使用原液。注意：在硫醇如二硫苏糖醇（DTT）和2-巯基乙醇存在下，Amplite Red底物不稳定。反应中DTT或2-巯基乙醇的最终浓度应不高于10μM。 Amplite Red底物在高pH（> 8.5）下也不稳定。因此，反应应在pH = 7-8下进行。推荐使用所提供的测定缓冲液，pH = 7.4。

2. HRP库存解决方案（500X）：
   将100μL测定缓冲液（组分B）加入到辣根过氧化物酶（组分C）的小瓶中。

3.黄嘌呤氧化酶（XO）标准溶液（1 U / mL）
将200μL测定缓冲液（组分B）加入黄嘌呤氧化酶标准品（组分E）的小瓶中。

 

2.标准溶液

XO标准
将10μL1U/ mL XO标准溶液加入990μL测定缓冲液（组分B）中以制备10mU / mL XO标准溶液（XO7）。 进行1：3连续稀释，得到剩余的连续稀释的XO标准品（XO6-XO1）。

 

3.工作溶液

将20μLDelterite Red储备溶液（250X），10μLHRP储备溶液（500X）和50μL黄嘌呤（100X，组分D）加入5mL分析缓冲液（组分B）中，使总体积为 5.08mL黄嘌呤氧化酶（XO）工作溶液,避光。

 

样品分析

表1.实心黑色96孔微孔板中XO标准品和测试样品的布局

BL	BL	TS	TS
XO1	XO1	...	...
XO2	XO2	...	...
XO3	XO3
XO4	XO4
XO5	XO5
XO6	XO6
XO7	XO7

表2.每个孔的试剂组成

孔	容积	试剂
XO1-XO7	50ul	连续稀释（0.01至10 mU / mL）
BL	50ul	分析缓冲液（组分B）
TS	50ul	样品

1.根据表1和表2中提供的布局，将XO标准品（XO），空白对照（BL）和测试样品（TS）制备成固体黑色96孔微孔板。对于384孔板，使用25μL 每孔试剂代替50μL。

2.向XO标准品，空白对照和测试样品的每个孔中加入50μLXO工作溶液，使总XO测定体积为100μL/孔。 对于384孔板，在每个孔中加入25μLXO工作溶液，总体积为50μL/孔。

3.在室温下孵育反应15至30分钟，避光。

4.用荧光板读数器在激发= 530-570nm，发射= 590-600nm（最佳Ex / Em = 540 / 590nm），截止= 570nm监测荧光强度。

 

参考文献

Xanthine oxidoreductase regulates macrophage IL1β secretion upon NLRP3 inflammasome activation
Authors: Annette Ives, Johji Nomura, Fabio Martinon, Thierry Roger, Didier LeRoy, Jeffrey N Miner, Gregoire Simon, Nathalie Busso, Alexander So
Journal: Nature communications (2015)