Amplite 荧光法髓过氧化物酶检测试剂盒 红色荧光

Amplite 荧光法髓过氧化物酶检测试剂盒是美国AAT Bioquest生产的葡萄糖检测的试剂盒，髓过氧化物酶(MPO)是一类具有过氧化物酶活性的绿色血红素蛋白，大量存在于中性粒细胞和单核细胞中。它可以催化来自细胞毒素酸或者其他中间产物的双氧水或者卤化物反应，在氧依赖性杀死肿瘤细胞和微生物过程扮演着重要的角色。MPO的缺乏症是一种遗传性的酶缺乏，诱发免疫缺陷。因此治疗MPO的抑制剂具有很大的发展前景。Amplite髓过氧化物酶检测试剂盒能提供一种快速灵敏的检测方法来测定溶解状态或者细胞裂解液中的MPO。本试剂盒可以用于96或384微孔板分析，并且无需任何分步骤，就可以轻易地实现自动化。这个试剂盒使用我们的Amplite Red底物使其成为双记录模式。红色的荧光信号很容易的通过荧光酶标仪（540／590nm）检测到或者被吸收酶标仪（576nm）检测到。通过Amplite 荧光髓过氧化物酶检测试剂盒在100 ul检测体积中能检测到5ng／ml的髓过氧化物酶。本试剂盒可以自动的高通量筛选MPO的抑制剂。百萤生物是AAT Bioquest的中国代理商，为您提供优质的Amplite 荧光法髓过氧化物酶检测试剂盒。 

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适用仪器

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荧光酶标仪
Ex:	540nm
Em:	590nm
Cutoff:	570nm
推荐孔板:	纯黑色孔板

样品实验方案

简要概述

1.MPO标准品或测试样品（50μL）
2.添加MPO工作溶液（50μL）
3.在室温下孵育30-60分钟
4.在Ex / Em = 540/590 nm处读取荧光强度（截止570 nm）

 

溶液制备 

1.储备溶液

所有未使用的储备溶液应分成一次性等分试样，并在制备后储存在-20°C。避免反复冻融循环。
1.1 Amplite 红色储备液（250X）：
将40μLDMSO（组分E）加入到Amplite Red底物（组分A）的小瓶中。应立即使用原液。注意：在硫醇如二硫苏糖醇（DTT）和2-巯基乙醇存在下，Amplite Red底物不稳定。反应中DTT或2-巯基乙醇的终浓度应不高于10μM。 Amplite Red底物在高pH（> 8.5）下也不稳定。因此，反应应在pH7-8下进行。推荐使用所提供的测定缓冲液，pH7.4。

1.2 H2O2储备溶液（500X，10 mM）：
将10μL的3％H₂O₂（0.88M，组分C）加入870μL的测定缓冲液（组分B）中。注意：稀释的H₂O₂溶液不稳定。应丢弃未使用的部分。

1.3 髓过氧化物酶（MPO）标准溶液（200 mU / mL）：
将50μL测定缓冲液（组分B）加入到髓过氧化物酶标准品（组分D）的小瓶中。注意：一个小瓶含有约5 - 10 mU的髓过氧化物酶。

2. HRP库存解决方案（50X）：
将1mL测定缓冲液（组分B）加入到辣根过氧化物酶（组分C）的小瓶中。

3.葡萄糖氧化酶标准溶液（100 U / mL）：
将1mL测定缓冲液加入葡萄糖氧化酶小瓶（组分D）中。

4.葡萄糖原液（10X）：
将5mL测定缓冲液加入葡萄糖小瓶（组分F）中。

 

2.标准溶液

MPO标准
将20μL200mU / mL MPO标准溶液加入380μL测定缓冲液（组分B）中，得到10 mU / mL MPO标准溶液（MPO7）。 取10 mU / mL MPO标准溶液进行1：3连续稀释，得到剩余的系列稀释MPO标准品（MPO6 - MPO1）。

 

3.工作溶液

将20μLDelterite 红色储备液（250X）和10μLH2O2（500X）加入5mL测定缓冲液（组分B）中，使总体积为5.03mL MPO工作溶液。 避光。

 

样品分析

表1. 96孔固体黑色微孔板中MPO标准品和测试样品的布局。 MPO =髓过氧化物酶标准品（MPO1-MPO7,0.01至10mU / mL）; BL =空白对照; TS =测试样品。

BL	BL	TS	TS
MPO1	MPO1	...	...
MPO2	MPO2	...	...
MPO3	MPO3
MPO4	MPO4
MPO5	MPO5
MPO6	MPO6
MPO7	MPO7

表2.每个孔的试剂组成。 注意，由于Amplite Red底物（非荧光产物）的过度氧化，高浓度的MPO可能导致荧光信号降低。

孔	容积	试剂
MPO1-MPO7	50ul	连续稀释（0.01至10 mU / mL）
BL	50ul	分析缓冲液（组分B）
TS	50ul	测试样本

1.根据表1和2中提供的布局制备髓过氧化物酶标准品（MPO），空白对照（BL）和测试样品（TS）。对于384孔板，每孔使用25μL试剂代替50μL。

2.向髓过氧化物酶标准品，空白对照和测试样品的每个孔中加入50μLMPO工作溶液，使总MPO测定体积为100μL/孔。 对于384孔板，在每个孔中加入25μLMPO工作溶液，总体积为50μL/孔。

3.在室温下孵育反应30至60分钟，避光。

4.用荧光板读数器在激发= 530-570nm，发射= 590-600nm（佳Ex / Em = 540 / 590nm，截止= 570nm）监测荧光强度。 注意：也可以将板的内容物转移到白色透明底板上，并用吸光度酶标仪在576±5nm的波长下读数。 与荧光读数相比，吸收检测具有更低的灵敏度。

 

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