Amplite 红色HRP荧光底物

Amplite 红色HRP荧光底物是美国AAT Bioquest生产的HRP荧光底物，Amplite Red是一种灵敏的荧光过氧化物酶底物，可产生高度红色荧光产物，大吸收为571 nm，大发射为585 nm。与其他HRP底物如二氢荧光素和二氢罗丹明不同，Amplite Red的空气氧化极少。 Amplite Red已被广泛用于检测许多免疫测定中的HRP。Amplite Red也可用于检测痕量的H₂O₂。 基于Amplite Red的H₂O₂检测比常用的用于H₂O₂的东莨菪素测定灵敏度至少高一个数量级。由于H₂O₂是在许多酶促氧化还原反应中产生的，因此Amplite Red可用于偶联酶促反应，以检测许多氧化酶和/或相关酶/底物或辅助因子如葡萄糖，乙酰胆碱和胆固醇，L-谷氨酸，氨基酸的活性等。百萤生物是AAT Bioquest的中国代理商，为您提供优质的Amplite 红色HRP荧光底物。 

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适用仪器

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荧光酶标仪
Ex:	540nm
Em：	590nm
cutoff:	550nm
推荐孔板:	纯黑色孔板

用Amplite Red测定过氧化物酶（HRP）的方案（用于96孔板）

概述

在磷酸盐缓冲液（50μL）中加入200μMH₂O₂制备1X Amplite Red工作溶液

加入过氧化物酶标准品或测试样品（50μL）

在室温下孵育10-30分钟

在Ex / Em = 540/590 nm处监测荧光强度

注意：以下是溶液中过氧化物酶测定的推荐方案。 该说明书仅提供指导，实际应根据具体需要进行修改。

 

操作方法

A1.准备Amplite Red过氧化物酶工作溶液：

1.1准备 250X Amplite Red原液：将200mL无水DMSO加入小瓶中，充分混合。 应立即使用原液。 任何未使用的溶液需要等分并在<-20℃重新冷冻。

注意：避免反复冻融循环，避免光照。

1.2制备1X Amplite 红色过氧化物酶工作溶液：在实验当天，将Amplite Red固体溶解在DMSO中或在室温下解冻等份的Amplite Red储备溶液。通过将20μL250XAmplite Red储备溶液（来自步骤1.1）加入5mL 50mM磷酸盐缓冲液或所选缓冲液（pH7）和200μMH₂O₂中，制备1X工作溶液。

注意：在硫醇如DTT和β-巯基乙醇存在下，Amplite Red不稳定。 高于10μM（终浓度）的硫醇可显著降低测定动态范围。NADH和谷胱甘肽（从GSH中还原）可能会干扰测定。

 

A2.在上清液中运行过氧化物酶测定：

2.1将50μL的1X Amplite 红色过氧化物酶工作溶液（来自步骤1.2）加入过氧化物酶标准品，空白对照和测试样品的每个孔中，使总过氧化物酶测定体积为100μL/孔。

注意：对于384孔板，在每个孔中加入25μL样品和25μL1XAmplite 红色过氧化物酶工作溶液。

2.2在室温下孵育反应10至30分钟，避光。

2.3使用荧光板读数器监测Ex / Em = 540/590 nm处的荧光增加。

2.4空白孔中的荧光（仅含测定缓冲液）用作对照，并从具有过氧化物酶反应的那些孔的值中减去。

 

使用Amplite Red测定H₂O₂的测定方案（一个96孔板）

概述

在磷酸盐缓冲液（50μL）中制备含有0.4 U / mL过氧化物酶的1X Amplite 红色H₂O₂工作溶液

添加H2O2标准品或测试样品（50μL）

在室温下孵育10-30分钟

监测Ex / Em = 540 / 590nm处的荧光强度

注意：以下是溶液中H₂O₂测定的推荐方案。 该说明书仅提供指导，实际应根据具体需要进行修改。

 

操作方法

B1.准备Amplite 红色H₂O₂工作溶液：

1.1Prepare 250X Amplite Red原液：将200μL无水DMSO加入小瓶中，充分混合。原液应立即使用不可存放过久。任何未使用的溶液需要等分并在<-20℃重新冷冻。

注意：避免反复冻融循环，避免光照。

1.2制备1X Amplite 红色H₂O₂工作溶液：在实验当天，将Amplite Red固体溶于DMSO中或在室温下解冻等份的Amplite Red原液。通过将20μL250X储备溶液（来自步骤1）加入5mL 50mM磷酸盐缓冲液或所选缓冲液（pH7）和0.4单位/ mL过氧化物酶中，制备1X工作溶液。

注意：在硫醇如DTT和β-巯基乙醇存在下，Amplite Red不稳定。 高于10μM（终浓度）的硫醇可显着降低测定动态范围。NADH和谷胱甘肽（从GSH中还原）可能会干扰测定。

 

B2.在上清液中进行H₂O₂测定：

2.1将50μL1XAmplite Red H₂O₂工作溶液（来自步骤1.2）加入H₂O₂标准品，空白对照和测试样品的每个孔中，使总H₂O₂测定体积为100μL/孔。

注意：对于384孔板，在每个孔中加入25μL样品和25μL1XAmplite Red H₂O₂工作溶液。

2.2在室温下孵育反应10至30分钟，避光。

2.3使用荧光板读数器监测Ex / Em = 540/590 nm处的荧光增加。

空白孔中的荧光（仅使用测定缓冲液）用作对照，并从具有H₂O₂反应的那些孔的值中减去。

 

参考文献

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